pEGFP-N1-H2B1質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染對小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡的影響.pdf

1、目的：心臟移植是臨床治療終末期心功能衰竭的唯一有效手段，但術(shù)后急、慢性排斥反應(yīng)嚴(yán)重制約著該技術(shù)的廣泛推廣應(yīng)用。研究誘導(dǎo)免疫耐受方案意義重大。母胎免疫耐受是天然的同種異體免疫耐受模型。位于母胎界面的絨毛膜組織不表達(dá)經(jīng)典的HLAI類分子而表達(dá)非經(jīng)典HLAI分子(包括HLA-G等)是母胎耐受的重要機制之一。本研究通過提取小鼠母胎界面的特異性的H281基因，構(gòu)建pEGFP-N1-H281質(zhì)粒載體，并轉(zhuǎn)染至小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞，觀察pEGFP-N1-

2、H281質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染對小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡的影響，探討利用母胎免疫耐受介導(dǎo)術(shù)后移植排斥反應(yīng)的機制。 方法：本研究分為兩部分： 第一部分雙酶切技術(shù)和基因測序?qū)χ亟MpEGFP-N1-H281質(zhì)粒載體進行鑒定； 第二部分轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-H281至小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞，觀察pEGFP-N1-H2B1質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染對小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡的影響。 pEGFP-N1-H281質(zhì)粒載體構(gòu)建過程中，首先在小鼠胎

3、盤提取總RNA，PCR擴增H2B1基因；然后用內(nèi)切酶EcoRI和BamHI雙酶切將PCR產(chǎn)物連接至T載體，并進行基因測序；最后利用內(nèi)切酶EcoRI和BamHI對重組TS-H2B1和pEGFP-N1進行雙酶切，將H2B1亞克隆至pEGFP-N1，并利用內(nèi)切酶Xhol、BamHI雙酶切法進行鑒定。轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-H2B1質(zhì)粒載體于小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞，并對小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞進行倒置顯微鏡下觀察、生長曲線繪制以及免疫組織化學(xué)進行鑒定。實驗分為

4、空白對照組和實驗組，分別以不同濃度的pEGFP-N1-H2B1質(zhì)粒載體進行干預(yù)：細(xì)胞刺激生長實驗分別以2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL，干預(yù)小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞，細(xì)胞計數(shù)觀察1-6天小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞的變化；MTT檢測小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖情況，分別以2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL干預(yù)小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞，以時間為橫軸，光吸收值為縱軸繪制細(xì)胞生長曲線；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞調(diào)亡，分別以2.5μg/mL、5μg/mL、10μ

5、g/mL干預(yù)小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后24 h、48 h、72 h處理細(xì)胞，觀察隨時間變化細(xì)胞凋亡情況，并繪制曲線。 結(jié)果：pEGFP-N1-H2B1質(zhì)粒載體構(gòu)建過程中，1％瓊脂糖凝膠中電泳對PCR產(chǎn)物進行檢測，觀察到在1070 bp處有一條亮帶，于H2b1基因的分子量相對應(yīng)；1％瓊脂糖凝膠中電泳對TS-H2B1載體的鑒定，觀察到三個克隆片段均在1070 bp處有一條亮帶，證明三個克隆片段均為正確克?。夯驕y序顯示只有兩個堿基突變

6、；XhoI、BamHI雙酶切法對pEGFP-N1-H2B1質(zhì)粒載體的鑒定，觀察到兩個克隆片段均在1070 bp處有一條亮帶，證明兩個克隆片段均為正確克隆。倒置顯微鏡觀察小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞生長情況，培養(yǎng)48h后，可見大部分貼壁細(xì)胞連接形成網(wǎng)狀，細(xì)胞密度較低；3-5d后，內(nèi)皮細(xì)胞島出現(xiàn)；約7-9d后細(xì)胞融合成片，細(xì)胞呈單層鑲嵌狀排列，呈現(xiàn)“鵝卵石樣"或“鋪路石樣”，出現(xiàn)接觸抑制現(xiàn)象。兔抗鼠抗Ⅷ抗體和熒光素標(biāo)記抗體鑒定結(jié)果顯示清晰的血管內(nèi)皮細(xì)胞

7、核。轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-H2B1質(zhì)粒載體于小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞，細(xì)胞刺激生長實驗顯示隨著pEGFP-N1-H2B1質(zhì)粒載體濃度的增大和時間的延長對細(xì)胞生長產(chǎn)生抑制作用；MTT檢測顯示空白對照組和實驗各組之間均有差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡顯示空白對照組和實驗各組之間均有差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 結(jié)論：pEGFP-N1-H2B1重組質(zhì)粒載體構(gòu)建成功。小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)成功。pEGF