pEGFP-N1-Igf1質(zhì)粒對大鼠牙囊細胞增殖及分化影響的初步研究.pdf

1、目的:構(gòu)建真核表達載體pEGFP-N1/Igf1，Igf1與EGFP融合表達。通過脂質(zhì)體介導pEGFP-N1/Igf1轉(zhuǎn)染SD大鼠牙囊細胞，分析其對細胞增殖及分化效應(yīng)的早期影響，為Igf1基因在牙周組織工程修復與再生中的應(yīng)用提供參考。
　　 方法:1.根據(jù)SD大鼠Igf1基因在GeneBank中的序列設(shè)計引物。巢氏PCR擴增出目的基因，與pMD-19T載體連接構(gòu)建pMD-19T/Igf1克隆載體。2.應(yīng)用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ及

2、XhoⅠ對pMD-19T/Igf1與pEGFP-N1質(zhì)粒進行雙酶切。使用連接酶SolutionⅠ連接酶切后的Igf1片段及pEGFP-N1片段。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后進行PCR、酶切、測序等鑒定。3.原代培養(yǎng)SD大鼠牙囊細胞，細胞傳至第四代時進行來源鑒定。實驗分組:①空白組、②pEGFP-N1/Igf1組、③pEGFP-N1+脂質(zhì)體組、④pEGFP-N1/Igf1+脂質(zhì)體組。4.熒光觀察:轉(zhuǎn)染后每隔24h在倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光的

3、表達情況，連續(xù)觀察96 h。5.細胞活力檢測（MTT法）:96孔板接種細胞，轉(zhuǎn)染后每隔24 h檢測各組細胞活力，連續(xù)檢測8d。6.ALP定量檢測（比色法）:24孔板接種細胞，轉(zhuǎn)染后每隔24 h收集細胞培養(yǎng)液檢測ALP含量，連續(xù)檢測6d。7.Ⅰ型膠原Col1α1及Col1α2基因表達檢測（熒光定量PCR法）:6孔板接種細胞，轉(zhuǎn)染48 h后收集細胞。以空白組為參照，計算其它處理組基因的相對表達量。
　　 結(jié)果:1.經(jīng)PCR、酶切、測

4、序等鑒定pEGFP-N1/Igf1質(zhì)粒構(gòu)建成功。2.綠色熒光觀察情況:轉(zhuǎn)染后48 h綠色熒光表達量最強。3.細胞增殖活力:轉(zhuǎn)染48 h-96 h細胞活力均為③④組＜①②組(p＜0.05)。轉(zhuǎn)染96 h時:①組＜②組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其余時間點差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。在轉(zhuǎn)染48 h時:③組＜④組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，其余時間點差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。4.胞外ALP活性:整體趨勢:①④兩組

5、較為接近，②組ALP含量在96 h內(nèi)始終高于其它組，在72 h時達到最峰，③組ALP含量在96 h內(nèi)始終低于其它組。轉(zhuǎn)染后24 h時:②組＞①組＞④組＞③組，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。轉(zhuǎn)染后48 h時:②組＞④組＞①組＞③組，除①④兩組差異無統(tǒng)計學意義（P=0.7＞0.5），其余均差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。轉(zhuǎn)染后72 h時:②組＞④組＞①組＞③組，除①④兩組差異無統(tǒng)計學意義(P=0.908＞0.5)，其余均差異均有統(tǒng)

6、計學意義(P＜0.05)。轉(zhuǎn)染后96 h時:②組＞①組＞④組＞③組，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。5.Col1α1及Col1以基因表達情況(轉(zhuǎn)染后48 h): Col1α1相對表達量:④組＞②組＞①組＞③組;Col1α2相對表達量:④組＞②組＞①組＞③組。
　　 結(jié)論:
　　 1.成功構(gòu)建Igf1基因C端融合EGFP的真核表達載體:pEGFP-N1/Igf1質(zhì)粒。2.脂質(zhì)體Lipofectamine2000介導的轉(zhuǎn)

7、染在轉(zhuǎn)染48 h時目的蛋白的表達最強。3.脂質(zhì)體Lipofectamine2000對SD大鼠牙囊細胞有一定的細胞毒性。pEGFP-N1/Igf1質(zhì)粒對細胞增殖有促進作用，裸質(zhì)粒組在轉(zhuǎn)染96 h時、脂質(zhì)體組在轉(zhuǎn)染48 h時對細胞的促增殖效應(yīng)最大。4.pEGFP-N1/Igf1質(zhì)?？稍鰪姲釧LP活性，具有一定的促SD大鼠牙囊細胞成骨向分化的作用。脂質(zhì)體的細胞毒性作用降低了胞外ALP活性，脂質(zhì)體組pEGFP-N1/Igf1質(zhì)粒促進ALP表達