HGF體外轉(zhuǎn)染骨骼肌細胞及其缺氧條件下對血管內(nèi)皮細胞凋亡的影響.pdf

1、血管生長因子在缺氧條件下的血管重建過程中，發(fā)揮著重要作用。肝細胞生長因子是血管內(nèi)皮細胞特異性的生長因子，促有絲分裂作用在所有血管內(nèi)皮細胞生長因子中最強。它與特異性受體C-met結(jié)合，在抗內(nèi)皮細胞凋亡、增強內(nèi)皮細胞屏障功能及促進內(nèi)皮依賴的血管擴張等方面發(fā)揮重要作用。目前普遍認為缺氧是血管再生的主要誘因，因此，本研究的目的是明確肝細胞生長因子對于缺氧誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞凋亡具有抑制作用。 目的： 將質(zhì)粒plRES2-EGFP-

2、HGF轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的大鼠骨骼肌細胞，觀察上清液中HGF的表達及其對缺氧誘導(dǎo)的大鼠血管內(nèi)皮細胞凋亡的影響。 方法： 1．胰酶消化法建立大鼠原代骨骼肌細胞，差速貼壁法純化，通過倒置相差顯微鏡觀察培養(yǎng)細胞的生長狀態(tài)，經(jīng)Desmin免疫細胞化學(xué)法和電鏡法鑒定；貼塊法建立大鼠原代血管內(nèi)皮細胞，Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫熒光鑒定。 2．提取、擴增質(zhì)粒piRES2-EGFP-HGF，酶切、測序鑒定；使用陽離子脂質(zhì)體向骨骼肌細胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒

3、pIRES2-EGFP-HGF，計算轉(zhuǎn)染效率；ELISA法測定轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后細胞上清液中HGF的表達濃度；并將上清液加入原代培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細胞。 3．將含0.5ng/ml、1.0ng/ml、2.0ng/ml、4.00ng/ml四種不同濃度HGF的上清液及空載質(zhì)粒組和空白對照組的細胞上清液加入到內(nèi)皮細胞培養(yǎng)液中。在2％缺氧條件下培養(yǎng)12小時后，Hoechst染色、倒置顯微鏡觀察血管內(nèi)皮細胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化。Annexin V-PI雙標

4、染法測定血管內(nèi)皮細胞早期凋亡率，檢測HGF對血管內(nèi)皮細胞早期凋亡的影響。 結(jié)果： 1．通過胰酶消化法建立了大鼠原代骨骼肌細胞，傳代時以差速貼壁法純化，使骨骼肌細胞純度達到95％以上，細胞融合分化后可見肌管形成，經(jīng)骨骼肌細胞特異性標志物Desmin免疫細胞化學(xué)法和電鏡法鑒定，證明培養(yǎng)的細胞是骨骼肌細胞，取2-4代做實驗用。 2．通過貼塊法建立了大鼠原代血管內(nèi)皮細胞，細胞融合可見典型的“鋪路石”樣表現(xiàn)，經(jīng)Ⅷ因子相關(guān)抗

5、原免疫熒光鑒定，證明培養(yǎng)的細胞是血管內(nèi)皮細胞，并取2-4代做實驗用。 3．使用陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine<'TM>2000、以質(zhì)粒：脂質(zhì)體比為1μg:2μl向骨骼肌細胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pIRES2-EGFP-HGF，以GFP熒光表達間接代表HGF表達，測定轉(zhuǎn)染效率為10.8％；ELISA法測定細胞上清液HGF濃度，轉(zhuǎn)染后1天、2天、3天、4天、5天、7天及9天的HGF濃度分別為743.5±170.5 pg/ml、1592.5

6、±135.8pg/ml、3424.5±160.3 pg/ml、5402.0±227.9 pg/ml、6883.8±191.3 pg/ml，3563.0±253.9 pg/ml，775.1±121.6pg/ml，空載組和空白對照組沒有測出HGF。 4．FCM結(jié)果表明HGF對由于缺氧引起的大鼠血管內(nèi)皮細胞凋亡具有明顯的抑制作用，細胞凋亡率隨著HGF濃度的增加而明顯降低，同對照組相比差異顯著(P<0.05)。 結(jié)論：