表沒食子兒茶素沒食子酸酯對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的大鼠心肌成纖維細(xì)胞功能的影響及分子機(jī)制研究.pdf

1、研究背景:
　　 心室重構(gòu)是心臟在多種形式的損傷因素作用下所產(chǎn)生的大小、形狀、室壁厚度和組織結(jié)構(gòu)等一系列變化，是病變修復(fù)和心室整體代償及繼發(fā)的病理生理反應(yīng)過(guò)程。在心室重構(gòu)中，多種炎癥細(xì)胞因子和神經(jīng)體液因子如血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)和內(nèi)皮素(endothelin，ET)等的作用，使心肌成纖維細(xì)胞（cardiac fibroblasts，CFs）通過(guò)分泌多種細(xì)胞因子與生長(zhǎng)因子、細(xì)胞外基質(zhì)(extracell

2、ular matrix，ECM)的合成與降解失衡、增殖、遷移和表型轉(zhuǎn)化等多種途徑，參與病理性心室重構(gòu)過(guò)程。臨床上預(yù)防細(xì)胞增殖和心肌纖維化是阻止心室重構(gòu)的關(guān)鍵。AngⅡ刺激CFs還可分泌多種細(xì)胞因子，這些因子以旁分泌或自分泌的方式調(diào)控CFs自身和周圍的心肌細(xì)胞代謝結(jié)構(gòu)功能而參與心肌重構(gòu)。AngⅡ受體有四種亞型，分別為AT1R、AT2R、AT3R和AT4R，目前認(rèn)為AngⅡ引起CFs產(chǎn)生的多種生物學(xué)效應(yīng)主要由AT1R介導(dǎo)，臨床上用AT1R受

3、體拮抗劑防治高血壓和心衰已取得較好的近期療效。AT1R又分為兩個(gè)亞型，即AT1aR和AT1bR。AT1受體為經(jīng)典的G蛋白偶聯(lián)受體(G protein coupled receptors，GPCRs)，因此對(duì)G蛋白信號(hào)通路的調(diào)控是心肌重構(gòu)潛在的治療靶點(diǎn)。
　　 AT1通過(guò)Gq蛋白激活磷脂酶C（Phospholipase C，PLC），水解二磷酸磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol4，5-bisphosphate，P

4、IP2）產(chǎn)生三磷酸肌醇(1，4，5，-trisphosphate，IP3)和二?；视?diacyl glycerol，DAG)，促使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+庫(kù)釋放Ca2+，引起胞內(nèi)游離Ca2+濃度瞬間增加，活化蛋白激酶C(protein kinaseC，PKC)，介導(dǎo)PKC-依賴性酪氨酸激酶途徑，刺激人CFs蛋白質(zhì)合成過(guò)程。
　　 受體在受到連續(xù)的刺激后通常會(huì)出現(xiàn)脫敏的現(xiàn)象。β-arrestin與G蛋白偶聯(lián)受體激酶(G-protein-

5、coupled receptor kinases，GRK)聯(lián)合作用，通過(guò)介導(dǎo)受體脫敏和內(nèi)吞，對(duì)大部分GPCRs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路具有重要的負(fù)調(diào)節(jié)作用。β-arrestin有β-arrestin1和2兩個(gè)亞型，廣泛的存在于各種細(xì)胞中。當(dāng)GPCRs被激活后，β-arrestin轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜，結(jié)合到被激動(dòng)劑占領(lǐng)的受體上，促使這些受體與G蛋白分離，從而導(dǎo)致受體脫敏?；罨摩?arrestin分子釋放出C末端，與胞內(nèi)小泡表面的網(wǎng)格蛋白(clathrin

6、)結(jié)合，介導(dǎo)GPCRs的內(nèi)吞。β-arrestin可以調(diào)節(jié)內(nèi)吞后GPCRs的運(yùn)輸模式，在GPCRs循環(huán)中起到了特別的作用。近期研究表明，β-arrestin不僅僅是信號(hào)的終止子，還是GPCRs介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的支架蛋白，他還可以改變G蛋白介導(dǎo)的第二信使通路激活MAPK。除了調(diào)節(jié)GPCRs的脫敏和信號(hào)傳遞，β-arrestin1還可以進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)直接或間接影響一些轉(zhuǎn)錄因子，在基因表達(dá)調(diào)控上發(fā)揮更多的功能，β-arrestin介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

7、和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)是細(xì)胞生物學(xué)的新發(fā)現(xiàn)，也是治療GPCRs功能失調(diào)疾病的新靶點(diǎn)。大鼠心梗后心衰模型的心肌β-arrestin-1 mRNA和蛋白表達(dá)均升高，免疫組化檢測(cè)提示β-arrestin-1可能是內(nèi)皮功能的主要調(diào)節(jié)因子。腎上腺過(guò)表達(dá)β-arrestin-1促進(jìn)心肌梗死后醛固酮水平的升高，從而加速心臟的有害再構(gòu)并降低心室功能。體內(nèi)抑制腎上腺β-arrestin-1基因表達(dá)后可顯著減少循環(huán)中醛固酮水平而阻止上述有害變化。AT1R拮抗劑氯沙坦不

8、能降低β-arrestin-1升高的醛固酮水平。對(duì)心衰動(dòng)物模型的研究提示，β1-腎上腺素受體和AT1R介導(dǎo)的β-arrestin依賴的EGFR/ERK信號(hào)活化對(duì)心臟起到了保護(hù)作用。
　　 表沒食子兒茶素沒食子酸酯(Epigallocatechin gallate，EGCG)是從綠茶中提取的一種單體成份，它是綠茶主要的活性和水溶性成份，是兒茶素中含量最高的組分，占綠茶毛重的9％-13％，具有潛在的抗炎、抗腫瘤等作用，同時(shí)對(duì)心臟的保

9、護(hù)作用也受到關(guān)注。EGCG被認(rèn)為介導(dǎo)一氧化氮引起的血管舒張，保護(hù)缺血再灌注心臟。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)EGCG可以有效地減輕壓力負(fù)荷造成的大鼠心臟肥厚和重構(gòu)，阻止心臟肥厚中的心肌細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制心肌成纖維細(xì)胞的異常增殖而改善心肌重構(gòu)，組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)EGCG可有效的減輕左心室心肌纖維化程度。因此EGCG可能成為治療患者心肌重構(gòu)的有效藥物。
　　 目前的研究多認(rèn)為EGCG對(duì)于心肌保護(hù)主要通過(guò)抑制氧化應(yīng)激，而沒有EGCG對(duì)心肌成

10、纖維細(xì)胞AngⅡ受體AT1R調(diào)節(jié)作用的報(bào)道。但在嗎啡引起的身體依賴性研究中發(fā)現(xiàn)，EGCG可以適度降低藍(lán)斑中嗎啡升高的cAMP水平，抑制多巴胺受體2(一種GPCRs)信號(hào)通路，對(duì)嗎啡引起的身體依賴性產(chǎn)生顯著地藥理作用。綜上所述，現(xiàn)有證據(jù)表明EGCG對(duì)G蛋白信號(hào)通路有確定作用，目前的研究多認(rèn)為EGCG的通過(guò)抑制氧化應(yīng)激發(fā)揮心臟保護(hù)作用，但尚不清楚EGCG對(duì)心肌成纖維細(xì)胞AngⅡ受體AT1R是否具有調(diào)節(jié)作用，同時(shí)β-arrestin是GPCR

11、s的重要調(diào)節(jié)分子。因此我們希望了解在心肌成纖維細(xì)胞異?；罨^(guò)程中，AT1R的調(diào)節(jié)分子β-arrestin發(fā)揮了怎樣的作用？EGCG是否通過(guò)調(diào)節(jié)β-arrestin影響AT1R而發(fā)揮抑制心肌成纖維細(xì)胞異常增殖的作用？
　　 本實(shí)驗(yàn)擬在體外用AngⅡ活化的新生大鼠心肌成纖維細(xì)胞為研究對(duì)象，采用小干擾RNA（small interfering RNAs，siRNA）、實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR(real-timequantitative

12、 reverse transcription PCR, RT-qPCR)和western blot等手段，探討β-arrestin在CFs中的表達(dá)和分布變化及其對(duì)AT1R信號(hào)的調(diào)控作用，以進(jìn)一步揭示CFs活化和ECM合成的機(jī)制，同時(shí)觀察EGCG對(duì)CFsβ-arrestins表達(dá)和AT1R信號(hào)的影響，以進(jìn)一步闡明其抑制心肌成纖維細(xì)胞增殖和活化的分子機(jī)制。
　　 研究目的:
　　 1.分離培養(yǎng)新生大鼠心肌成纖維細(xì)胞，觀察EG

13、CG對(duì)正常CFs和血管緊張素Ⅱ異?；罨疌Fs功能的影響。
　　 2.探討EGCG對(duì)心肌成纖維細(xì)胞β-arrestin-1和β-arrestin-2表達(dá)的影響，揭示β-arrestin表達(dá)變化與細(xì)胞活性之間的相關(guān)性。
　　 3.闡明β-arrestin-1對(duì)心肌成纖維細(xì)胞AT1R表達(dá)、細(xì)胞活性、增殖和膠原合成能力的影響及EGCG的作用。
　　 4.揭示EGCG對(duì)血管緊張素Ⅱ受體AT1R-Gq-PKC信號(hào)通路的影響。

14、
　　 研究方法:
　　 1.新生大鼠心肌成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)和鑒定
　　 取新生1～3天的Sprague-Dawley(SD)大鼠，在超凈工作臺(tái)上無(wú)菌取出心臟，分離心室肌組織，剪碎，用胰蛋白酶和Ⅰ型膠原酶消化成單細(xì)胞懸液，去除非貼壁細(xì)胞，貼壁細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)。進(jìn)行細(xì)胞爬片，冷丙酮固定后用免疫組化法檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞中波形蛋白（成纖維細(xì)胞中大量表達(dá)）的表達(dá)情況，染色陽(yáng)性證實(shí)為心肌成纖維細(xì)胞。第2～～4代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

15、>　　 2.體外給藥分組
　　 細(xì)胞同步化后，用AngⅡ(1×10-7 mol/L)體外作用CFs，設(shè)EGCG(1×10-9，1×10-8，1×10-7，1×10-6，1×10-5 mol/L)五個(gè)給藥組，用血管緊張素Ⅱ受體反向激動(dòng)劑纈沙坦(valsartan，Val)(1×10-6mol/L)作為陽(yáng)性對(duì)照給藥，給藥后培養(yǎng)24小時(shí)，并設(shè)正常CFs組。檢測(cè)EGCG對(duì)正常CFs的影響設(shè)正常細(xì)胞組和EGCG（1×10-5 mol/L

16、）給藥組。
　　 3.CFs細(xì)胞活力檢測(cè)
　　 采用3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(3-(4，5-Dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT)法檢測(cè)CFs的活力。同步化后體外用AngⅡ刺激或給予不同濃度EGCG處理后培養(yǎng)24h，終止培養(yǎng)前6h每孔加入MTT，棄去上清后每孔加入二甲亞砜(Dimethyl sulfoxide，D

17、MSO)，震蕩30s后于酶標(biāo)儀570nm處檢測(cè)吸光度值。
　　 4.CFs細(xì)胞增殖能力和膠原合成量檢測(cè)
　　 采用3H-TdR參入法檢測(cè)CFs的增殖能力，3H-羥脯氨酸參入法檢測(cè)膠原合成量。細(xì)胞同步化后體外用AngⅡ刺激或給予不同濃度EGCG處理后培養(yǎng)24h，終止培養(yǎng)前6h每孔加入3H-TdR或3H-羥脯氨酸，培養(yǎng)結(jié)束用胰酶消化細(xì)胞，用多頭細(xì)胞收集儀收集細(xì)胞至玻璃纖維紙上，烘干后加入閃爍液溶解，以液體閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)定每分鐘

18、的脈沖數(shù)cpm。
　　 5.RT-qPCR檢測(cè)
　　 用Trizol法提取CFs總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以GAPDH為參照，通過(guò)RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)β-arrestin-1、AT1aR和AT1bR mRNA水平的表達(dá)。
　　 6.Western blot檢測(cè)
　　 CFs中加入適量細(xì)胞裂解液，反復(fù)凍融破碎細(xì)胞，3000×g離心，提取上清即為細(xì)胞總蛋白，用Lowry法定量后加入上樣緩沖液，煮沸，進(jìn)

19、行聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)，經(jīng)過(guò)分離、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗、二抗、顯色等，分別檢測(cè)細(xì)胞總β-arrestin-1、β-arrestin-2、AT1R、Gq的表達(dá)水平。細(xì)胞總蛋白繼續(xù)用37000×g離心，上清為胞漿蛋白，定量后用于檢測(cè)細(xì)胞漿磷酸化PKC-delta的表達(dá)情況;沉淀用細(xì)胞裂解液溶解后定量，用于檢測(cè)

20、細(xì)胞膜β-arrestin-1、ATⅡR和磷酸化PKC-delta(p-PKC-delta)表達(dá)水平。采用廣譜鈣粘附素(pan cadherin)鑒定胞漿胞膜蛋白的分離效率。
　　 7.大鼠CFsβ-arrestin-1的siRNA沉默
　　 用β-arrestin-1的siRNA干擾試劑盒干擾大鼠CFs中β-arrestin-1基因表達(dá)。設(shè)計(jì)3對(duì)干擾序列。CFs用不含抗生素的血清培養(yǎng)到70％以上融合，吸棄舊培養(yǎng)液，PB

21、S洗滌，加不含抗生素、含5％胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的DMEM。將siRNA/Lipofectamin2000復(fù)合物，加到含有細(xì)胞和Opti-MEM培養(yǎng)基的6孔板中。孵育6h后，除去復(fù)合物，更換5％ DMEM，再培養(yǎng)24h、48h、72h。熒光顯微鏡觀察最佳轉(zhuǎn)染時(shí)間，提取蛋白，進(jìn)行Western Blot檢測(cè)，確定最佳干擾序列和干擾效率。
　　 8.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 所有數(shù)據(jù)用SPSS17

22、.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)值變量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，兩組間均數(shù)比較采用小樣本T檢驗(yàn)，多組間差異顯著性比較采用One-Way ANOVA方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 研究結(jié)果:
　　 1.心肌成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)情況
　　 用倒置顯微鏡觀察，心肌成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，2～3天即呈匯合狀態(tài)，細(xì)胞排列整齊緊密，有的交叉重疊生長(zhǎng)。心肌成纖維細(xì)胞呈梭形，胞體較大，胞質(zhì)透明;細(xì)胞核較大，呈

23、橢圓形，通常含2～3個(gè)核，無(wú)自發(fā)性搏動(dòng)。
　　 2.心肌成纖維細(xì)胞的鑒定
　　 用免疫組化法檢測(cè)上述方法培養(yǎng)的第2代新生大鼠心臟細(xì)胞中波形蛋白表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞波形蛋白染色呈強(qiáng)陽(yáng)性，符合心肌成纖維樣細(xì)胞的特征。
　　 3.EGCG對(duì)正常大鼠心肌成纖維細(xì)胞活力、增殖和膠原合成的影響
　　 EGCG對(duì)正常大鼠CFs的細(xì)胞活力、增殖和膠原合成能力均無(wú)顯著影響(P＞0.05)。說(shuō)明EGCG對(duì)正常CFs沒有抑制作用

24、。
　　 4.EGCG對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的大鼠心肌成纖維細(xì)胞活力、增殖和膠原合成的影響
　　 MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，EGCG1×10-7-1×10-5 mol/L濃度依賴性的抑制AngⅡ誘導(dǎo)的CFs細(xì)胞活力(P＜0.05或P＜0.01)，Val1×10-6 mol/L也具有明顯的抑制作用(P＜0.01);AngⅡ作用24h后，細(xì)胞3H-TdR和3H-羥脯氨酸的參入量顯著增多，EGCG1×10-7-1×10-5 mol/L顯著抑制

25、AngⅡ作用下CFs的增殖能力(P＜0.05或P＜0.01)，EGCG1×10-6-1×10-5 mol/L明顯減少活化CFs膠原的產(chǎn)生(P＜0.05或P＜0.01)，Val均可以抑制AngⅡ誘導(dǎo)的CFs增殖和膠原合成(P＜0.01)。以上結(jié)果提示，EGCG體外對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的CFs異?；罨⒃鲋澈湍z原合成有顯著恢復(fù)作用。
　　 5.EGCG對(duì)AngⅡ作用下CFsβ-arrestin-1和β-arrestin-2表達(dá)水平的影響與

26、其對(duì)細(xì)胞活力影響的相關(guān)性分析
　　 AngⅡ作用下，CFs中β-arrestin-1 mRNA的表達(dá)水平顯著升高(P＜0.01)，EGCG1×10-6、1×10-5 mol/L顯著恢復(fù)β-arrestin-1 mRNA水平(P＜0.01)。然而，AngⅡ的刺激和EGCG體外給藥均不能影響CFs中β-arrestin-2的蛋白表達(dá)水平(P＞0.05)。上述研究結(jié)果證實(shí)，β-arrestin-1參與了AngⅡ誘導(dǎo)的CFs活化，而β-

27、arrestin-2作用不明顯，且β-arrestin-1也是EGCG發(fā)揮作用的分子靶點(diǎn)之一。將EGCG對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)下CFs活力的影響和β-arrestin-1 mRNA水平的影響進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，二者存在顯著地正相關(guān)(R2=0.9304，P=0.0019)。以上結(jié)果提示，EGCG對(duì)CFs活力的抑制作用與減少β-arrestin-1基因表達(dá)有關(guān)，β-arrestin-1在CFs的異?；罨锌赡芷鸬酱龠M(jìn)作用。
　　 6.β-a

28、rrestin-1在AngⅡ誘導(dǎo)CFs AT1R表達(dá)、細(xì)胞活化、增殖和膠原合成中的作用及EGCG的影響
　　 為進(jìn)一步確定β-arrestin-1在CFs活化中的作用，我們用siRNA沉默CFs中β-arrestin-1的表達(dá)，RT-qPCR和western blot法篩選出最佳干擾序列為Sense:5’-AGC CUUCUGUGCUGAGAACTT-3’,Anti-sense:5’-GUUCUCAGCACAGAAGGCUTT-

29、3’，該序列可以減少56.7％的β-arrestin-1基因表達(dá)和55％的蛋白表達(dá)。與對(duì)照序列相比，在沉默了β-arrestin-1基因的CFs中加入AngⅡ培養(yǎng)24h，細(xì)胞膜AT1R分布明顯增多(P＜0.05)，對(duì)細(xì)胞活力、細(xì)胞增殖能力和膠原合成能力的影響明顯減小(分別為P＜0.01、P＜0.01和P＜0.05); EGCG1×10-5 mol/L體外給藥可以進(jìn)一步升高AngⅡ作用下AT1R膜表達(dá)(P＜0.05)，抑制細(xì)胞的活力和增殖

30、能力(P＜0.05)，但對(duì)膠原合成沒有明顯影響(P＞0.05)。以上結(jié)果證明，β-arrestin-1調(diào)節(jié)AT1R內(nèi)吞，是參與AngⅡ介導(dǎo)CFs活化過(guò)程的關(guān)鍵分子，也是EGCG發(fā)揮治療作用的重要靶點(diǎn)。
　　 7.EGCG對(duì)AngⅡ作用下CFs中AT1R、β-arrestin-1和Gq表達(dá)的影響
　　 在AngⅡ刺激下，CFs中AT1aR mRNA水平降低(P＜0.05)，EGCG1×10-5 mol/L體外給藥可以使其恢

31、復(fù)到接近正常水平，但AT1bR mRNA水平?jīng)]有明顯變化，提示AngⅡ主要通過(guò)影響AT1aR發(fā)揮活化CFs的作用。進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，AngⅡ誘導(dǎo)的CFs中β-arrestin-1總表達(dá)和胞膜表達(dá)均明顯升高(P＜0.01)，而AT1R總表達(dá)和胞膜表達(dá)均降低(P＜0.01)，Gq蛋白總表達(dá)減少(P＜0.01)。EGCG1×10-5 mol/L減少β-arrestin-1的總表達(dá)(P＜0.05); EGCG1×10-6和1×10-5 mol/L

32、不同程度減少β-arrestin-1的胞膜表達(dá)(P＜0.01和P＜0.05);EGCG1×10-6和1×10-5 mol/L顯著升高AT1R總表達(dá)和胞膜表達(dá);然而EGCG對(duì)Gq蛋白的表達(dá)減少?zèng)]有恢復(fù)作用。
　　 8.EGCG對(duì)AngⅡ作用下CFs中p-PKC-delta表達(dá)的影響
　　 與正常細(xì)胞相比，AngⅡ刺激CFs使細(xì)胞漿中p-PKC-delta表達(dá)明顯減少，EGCG1×10-6和1×10-5 mol/L體外給藥顯

33、著升高降低的胞漿p-PKC-delta水平，但AngⅡ和EGCG均不能影響胞膜p-PKC-delta的表達(dá)。
　　 結(jié)論:
　　 1.細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和免疫組化法共同證實(shí)用酶消化法分離心室肌組織得到的貼壁細(xì)胞為心肌成纖維細(xì)胞。
　　 2.EGCG體外給藥對(duì)正常CFs的細(xì)胞活力、增殖和膠原合成能力沒有影響，而對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)下CFs的異?；罨⒃鲋澈湍z原合成有顯著抑制作用。
　　 3.β-arrestin-1是

34、參與AngⅡ介導(dǎo)CFs活化過(guò)程的關(guān)鍵分子，β-arrestin-2未發(fā)揮明顯作用。
　　 4.β-arrestin-1調(diào)節(jié)AT1R內(nèi)吞，在CFs的異?；罨锌赡芷鸬酱龠M(jìn)作用，EGCG對(duì)CFs活力的抑制作用與減少β-arrestin-1表達(dá)、抑制AT1R內(nèi)吞有關(guān)。
　　 5.AngⅡ主要通過(guò)影響AT1aR及其下游信號(hào)通路活化CFs，EGCG通過(guò)抑制β-arrestin-1的總表達(dá)和胞膜表達(dá)，不同程度的恢復(fù)AT1R下游信號(hào)分