表沒食子兒茶素沒食子酸酯氧化產(chǎn)物的制備、鑒定及其活性研究.pdf

1、目前國內(nèi)外對茶多酚及其各兒茶素單體的化學(xué)及生物活性的研究已十分系統(tǒng)深入,而對兒茶素氧化產(chǎn)物的研究卻起步較晚。有關(guān)兒茶素的轉(zhuǎn)化及形成的氧化產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)與生物活性的關(guān)系也很少有詳細(xì)的研究報道。以往的觀點認(rèn)為,氧化會破壞兒茶素氧化產(chǎn)物的生物活性,但近年有研究表明,兒茶素氧化產(chǎn)物可能有比兒茶素更強的生物活性。為進(jìn)一步深入研究酚類氧化產(chǎn)物,本文以兒茶素中活性最強的表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)為代表,確定了其體外最佳氧化條件、氧化動力學(xué)模

2、型,并對EGCG氧化產(chǎn)物的分離、純化、鑒定及活性等進(jìn)行了系列研究,主要結(jié)果如下:
　　 1 EGCG體外最佳氧化條件的確定
　　 通過單因素實驗及響應(yīng)面分析,考察了反應(yīng)溫度、氧化時間、反應(yīng)體系pH值、氧化劑與EGCG質(zhì)量比對EGCG氧化反應(yīng)液抗·OH活性的影響,并以·OH抑制率為指標(biāo),確定EGCG體外最佳氧化條件為:溫度25℃,氧化時間15min,反應(yīng)體系pH7.0,氧化劑與EGCG的質(zhì)量比1.5:1。在此條件下,氧化反

3、應(yīng)液的·OH抑制率最高,可達(dá)53.40％,且超過了EGCG對·OH的抑制率41.50％。即適度氧化時,EGCG氧化反應(yīng)液的活性最強。
　　 2 EGCG體外氧化動力學(xué)的研究
　　 HPLC/MS分析表明,EGCG氧化反應(yīng)液中主要存在3種氧化低聚物(EOP),且均屬于EGCG氧化二聚體。動力學(xué)的研究表明,在反應(yīng)前期(0-10min),EGCG氧化及EOP生成為二級動力學(xué)的反應(yīng)機理。二者反應(yīng)速率均隨溫度的升高及氧化劑所占質(zhì)量

4、比的增大而加快；在堿性條件下,二者反應(yīng)速率較快。
　　 從有利于EOP的形成及保持其穩(wěn)定看來,EOP生成的最適條件為:溫度25℃,pH7.5,氧化劑與底物的質(zhì)量比為1.5:1,氧化時間15min,與以·OH抑制率為指標(biāo)所確定的EGCG體外最佳氧化條件基本一致,說明EOP可能為EGCG氧化反應(yīng)液中抗·OH的主要活性成分。
　　 3 EGCG氧化產(chǎn)物的分級分離及其活性
　　 采用萃取法初步分級分離EGCG氧化產(chǎn)物,中

5、性條件下萃取得到的級分Fra.A中主要含有產(chǎn)物1、2及EGCG；酸性條件下萃取得到的級分Fra.B中主要含有產(chǎn)物1、3,幾乎不含EGCG,其中產(chǎn)物1、2、3均為EGCG氧化二聚體。
　　 體外抗氧化研究表明,Fra.A及Fra.B可有效清除超氧陰離子、羥基自由基、過氧化氫,抑制DNA氧化損傷。其中,Fra.A的抗氧化活性超過了未氧化的EGCG,而Fra.B的抗氧化活性略低于EGCG。抑菌實驗表明,級分Fra.A和Fra.B對細(xì)菌

6、有較強的抑制作用,對真菌、酵母菌無明顯的抑制作用。通過比較,Fra.A和Fra.B的抑菌活性都略低于未氧化的EGCG。
　　 4 EGCG氧化產(chǎn)物單體的制備及結(jié)構(gòu)鑒定
　　 建立了EGCG氧化產(chǎn)物單體的純化、制備方法,其中級分Fra.B經(jīng)Sephadex LH-20(40cm×1.5cm i.d.)柱層析,用70％甲醇以流速1mL/min洗脫,收集主要色譜峰洗脫液可得EGCG氧化產(chǎn)物單體3,經(jīng)濃縮、冷凍干燥為淡黃色粉末；

7、級分Fra.C經(jīng)D101大孔吸附樹脂(20cm×1.0cm i.d.)脫鹽后,用80％乙醇洗脫(自然流速),收集此部分洗脫液,經(jīng)乙酸乙酯萃取后可直接得EGCG氧化產(chǎn)物單體1,濃縮、冷凍干燥后為橙紅色粉末。
　　 經(jīng)UV-VIS、HPLC-ESI-MS及NMR等方法分析,推斷產(chǎn)物1可能為dehydrotheasinensin A(m/z929),產(chǎn)物3可能為theacitrin C(m/z911),二者均為EGCG B環(huán)間聚合形成

8、的二聚體。
　　 5 EGCG氧化產(chǎn)物單體的抗氧化活性
　　 進(jìn)一步研究了EGCG氧化產(chǎn)物單體dehydrotheasinensin A及theacitrin C的體外抗氧化活性。研究結(jié)果表明,在所測試的四個體系中,dehydrotheasinensin A及theacitrin C均顯示出優(yōu)異的抗氧化活性。二者清除超氧陰離子的能力分別為EGCG的1.48倍和1.32倍,清除羥基自由基的能力分別為EGCG的1.41倍和1