表沒食子兒茶素沒食子酸酯對結腸癌的預防作用及其相關機制研究.pdf

1、研究背景： 在我國結腸癌是常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率很高。隨著我國的經(jīng)濟發(fā)展和人民生活水平的不斷提高，生活方式及膳食結構的改變，結腸癌的發(fā)病率有逐年上升的趨勢。烹調的肉類食品中存在多種雜環(huán)胺類(HCAs)致癌和致突變物，HCAs為存在于烤、焙肉和魚中的基因毒化合物，人們幾乎每天都暴露在誘變劑(或致癌劑)雜環(huán)胺類物質中。流行病學的研究表明，當人們攝入相對大量的過熟肉類時，罹患結直腸癌的風險顯著升高。其中2-氨基3-甲基咪唑(4，5

2、-f)喹啉(IQ)是雜環(huán)胺類中含量相對較多的一種，可以導致結腸腫瘤的基因突變和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性，從而具有明顯致癌作用。 雖然現(xiàn)在人們對結腸癌的的研究已經(jīng)取得了很大的進展，但是始終不能改變其發(fā)病率高、死亡率高的現(xiàn)狀。目前，由于食物的應用方便及無毒害等優(yōu)點，飲食中的化學防癌物品成為人們研究的熱點，如：姜黃素、萊菔子素、番茄素等。這些物質其化學預防的作用可能在于：一是有些植物化學成分能阻止人體內(nèi)致癌物的形成：二是能激活細胞中的蛋白分子：

3、從而把侵入人體細胞的致癌物質裹起來，并將致癌物排出體外，阻止了致癌物對細胞核的損傷，保證了基因的完好。三是能消滅癌癥的初始病灶，抑制癌變區(qū)生長毛細血管，使癌變部位因缺氧和營養(yǎng)不足而萎縮死亡。四是能促進人體淋巴細胞的形成，淋巴細胞能參與機體圍殲癌瘤的戰(zhàn)斗。 茶的保健作用自古以來就有記載，茶多酚是茶葉中三十多種多酚類物質的總稱，是一種從綠茶中提取的純天然混合物，主要由四大類物質組成，其中以兒茶素最為重要，約占多酚類總量的60～80﹪

4、，兒茶素類主要由表沒食子兒茶素(EGC)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、表兒茶素(EC)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)等幾種單體組成，其中以表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)的含量最豐富。研究表明：EGCG在體內(nèi)外通過多種信號途徑抑制腫瘤細胞的增殖和促進其凋亡，也可以誘導腸道中的Ⅱ相代謝酶，從而起到預防腫瘤的作用。尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉移酶(UGT)是化學物質在體內(nèi)生物轉化第Ⅱ時相中最重要的代謝酶，能催化葡萄糖醛酸與多種化學

5、物質進行葡萄糖醛酸結合反應，使其水溶性增加，從而隨尿液和膽汁排出。雖然肝臟微粒體是葡萄糖醛酸結合反應的主要部位，但在胃腸道中可以特異地檢測到UGTlA8及IJGTlA10的表達。胃腸道的葡萄糖醛酸化反應是肝臟解毒反應的補充，發(fā)揮著胃腸道粘膜的代謝屏障作用。 研究目的： 1．觀察不同濃度EGCG對致癌物IQ所誘導的裸鼠結腸粘膜ACF形成的影響，觀察結腸病理形態(tài)改變，并分析Nrf2和IJGTlAlO的mRNA和蛋白表達的變化

6、情況，從而探討EGCG預防結腸癌前病變的可能分子機制。 2．首先建立裸鼠皮下HT-29結腸腫瘤模型，再利用皮下腫瘤組織，建立裸鼠結腸原位腫瘤模型，觀察不同濃度EGCG對結腸腫瘤原位生長、腹膜轉移、腹水形成、肝肺轉移的抑制作用，分析腫瘤組織內(nèi)Nrf2、LIGTlA、LJGTlA8和UGTlA10的mRNA和蛋白表達的變化情況，探討EGCG是否通過誘導UGTlA及其同工酶的表達而起到預防結腸癌的原位生長與轉移的作用。 3．體

7、外封閉HT-29結腸癌細胞中Nrf2基因的表達，用低表達Nrf2基因的FrF-29結腸癌細胞建立裸鼠皮下腫瘤模型，然后建立裸鼠結腸原位腫瘤模型，觀察不同濃度EGCG對結腸腫瘤原位生長、腹膜轉移、腹水形成、肝肺轉移的抑制作用，分析腫瘤組織內(nèi)Nrf2、LIGTlA、LJGTlA8和IJGTlAl0的mRNA和蛋白表達的變化情況，探討Nrf2基因在EGCG誘導UGTlA及其同工酶的表達中的橋梁作用。 研究方法： 1-用致癌物I

8、Q誘導裸鼠結腸粘膜隱窩發(fā)生畸變的動物模型，觀察低、中、高劑量不同濃度EGCG(5，10和20mg/kg．d)預先作用于小鼠后，0.2﹪亞甲藍染色觀察ACF數(shù)目及畸變隱窩(AC)的數(shù)目，HE染色觀察結腸粘膜組織的病理改變，免疫組化和Western-Blotting檢測結腸組織中Nrf2基因的蛋白表達水平，RT-PCR檢測Nrf2和UGTlA10基因的mRNA表達水平，分析ACF的形成與Nrf2和IJGTlAlO基因表達間的關系。

9、2．體外常規(guī)培養(yǎng)HT-29結腸癌細胞至對數(shù)生長期，在裸鼠皮下建立腫瘤模型，反復傳代5次，切下皮下腫瘤，建立裸鼠結腸原位腫瘤模型，觀察低、中、高劑量不同濃度EGCG(5，10和20mg/kg.d)預先作用于小鼠后，肉眼觀察有無腹膜轉移、腹水形成，HE染色觀察肝肺組織的病理學改變，免疫組化和Western-blotting檢測大腸組織中Nrf2基因的蛋白表達水平，RT-PCR檢測Nrf2、UGTlA、LJGTlA8和UGTlA10基因的mR

10、NA表達水平，分析不同劑量EGCG對裸鼠結腸原位生長和轉移的抑制作用，及其對Nrf2、UGTlA、UGTlA8和UGTlA10基因的誘導表達作用。 3．利用RNA干擾技術封閉Nrf2基因的表達，建立低表達Nrf2基因的HT-29結腸癌細胞系，培養(yǎng)其至對數(shù)生長期，在裸鼠皮下建立腫瘤模型，反復傳代5次，切下皮下腫瘤，建立裸鼠結腸原位腫瘤模型，觀察低、中、高劑量不同濃度EGCG(5，10和20mg/kg．d)預先作用于小鼠后，肉眼觀察

11、有無腹膜轉移、腹水形成，HE染色觀察肝肺組織的病理學改變，免疫組化和Western-blotting檢測腫瘤組織中Nrf2基因的蛋白表達水平，RT-PCR檢測Nrf2、UGTlA、UGTlA8和UGTlA10基因的mRNA表達水平，分析不同劑量EGCG對裸鼠結腸原位生長和轉移的抑制作用，反向驗證Nrf2在不同劑量EGCG誘導UGTlA、UGTlA8和UGTlA10基因的誘導表達中的作用。 4．統(tǒng)計學方法：應用SPSS13．0統(tǒng)計

12、軟件進行分析，計量資料的數(shù)據(jù)均以Means±SD表示，對成組設計的多個樣本均數(shù)的比較，進行方差分析；計數(shù)資料的數(shù)據(jù)均以﹪表示，對所得計數(shù)資料進行卡方檢驗。P<0.05為差異有顯著性。 研究結果： 1.IQ處理組裸鼠的體重明顯下降，結腸粘膜呈現(xiàn)高度不典型增生并形成大量ACF。不同濃度EGCG處理后，裸鼠體重明顯上升，病理改變趨于正常，ACF數(shù)目明顯下降，免疫組化和免疫印跡檢測大腸組織Nrf2蛋白表達水平明顯高于IQ組(P<

13、0.05)，且在免疫組化中發(fā)現(xiàn)Nrf2有核轉錄現(xiàn)象，RT-PCR檢測Nrf2和LIGT1A10的mRNA表達水平明顯高于IQ組(P<0.05)。 2．用HT-29結腸腫瘤細胞建立結腸原位腫瘤模型組的裸鼠有少數(shù)發(fā)生惡液質及消瘦的現(xiàn)象，不同劑量EGCG處理后，裸鼠體重上升，并明顯抑制結腸原位腫瘤的生長及多處轉移(腹膜、腹腔和肝肺)，免疫組化和免疫印跡檢測腫瘤組織Nrf2基因的蛋白表達水平明顯高于模型組(P<0.05)，且在免疫組化中

14、發(fā)現(xiàn)Nrf2有核轉錄現(xiàn)象，RT-PCR檢測Nrf2、IJGTlA、UGT1A8和LJGT1A10基因的mRNA表達水平明顯高于模型組(P<0.05)。 3．用HT-29-siNrf2結腸腫瘤細胞建立結腸原位腫瘤的各組裸鼠，體重無明顯差異，不同劑量EGCG處理后，并無明顯抑制結腸原位腫瘤的生長及多處轉移(腹膜、腹腔和肝肺)，免疫組化和免疫印跡檢測腫瘤組織Nrf2基因的蛋白表達水平與模型組比較無明顯差異(P<0.05)，RT-PCR

15、檢測Nrf2、LIGT1A、LIGT1A8和UGT1A10基因的mRNA表達水平與模型組比較無明顯差異(P>0.05)。 研究結論： 1.不同劑量EGCG能抑制IQ誘導的裸鼠結腸ACF的形成，進而預防結腸癌的發(fā)生，并且有劑量依賴效應，這種作用可能是通過誘導Nrf2和LJGT1A10基因的表達，從而增加腸粘膜對IQ的清除，減少IQ誘導的ACF形成來實現(xiàn)的。 2．不同劑量．EGCG能夠抑制裸鼠HT-29結腸原位腫瘤的

16、局部生長和遠處轉移，并且有劑量依賴效應，這種作用可能是通過誘導Nrf2、IJGT1A、LIGT1A8和UGT1A10基因的表達，從而增加腸粘膜對腫瘤組織的抵抗性(局部浸潤和遠處轉移)。 3．與模型組(低表達Nrf2的結腸腫瘤細胞系建立的結腸原位腫瘤)相比，不同劑量EGCG對結腸原位腫瘤的局部生長和遠處轉移均無明顯抑制作用，也并不能明顯誘導Nrf2、UGTlA、UGTlA8和LJGTlA10基因的表達，說明Nrf2在EGCG誘導U

17、GTlA及其同工酶表達中起到關鍵作用。研究意義： 1．本研究證實了不同劑量EGCG可以抑制IQ誘導的結腸ACF的形成，構建了結腸癌植物化學保護劑的動物模型，為結腸癌預防的體內(nèi)研究奠定實驗基礎。 2．本研究證實了不同劑量EGCG可以抑制裸鼠結腸原位腫瘤的局部生長和多處轉移，并且率先在結腸原位腫瘤模型中提出了EGCG可以誘導Nrf2-UGTlA信號通路中基因表達的作用，這為模擬人體內(nèi)結腸腫瘤的生長、轉移，探求結腸腫瘤的植物化