重組人紅細(xì)胞生成素改善UUO大鼠腎臟纖維化的研究.pdf

1、目的：各種慢性腎臟病變進展到腎衰竭，病理變化均表現(xiàn)為腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化。腎間質(zhì)纖維化的程度與腎功能損害程度有很高的相關(guān)性，故常以間質(zhì)纖維化作為評價腎臟疾病進展程度的可靠指標(biāo)。腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展機制復(fù)雜，其中腎小管上皮肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化（tubular epithelial-myofibroblast transdifferentiation，TEMT）在其發(fā)生發(fā)展中起重要作用。
　　 促紅細(xì)胞生成素（erythro

2、poietin，EPO）是由腎臟分泌的內(nèi)源性細(xì)胞因子，主要作用是通過促進骨髓中紅系祖細(xì)胞的存活、增殖和分化來調(diào)控紅細(xì)胞的生成，臨床上廣泛應(yīng)用于慢性腎衰患者貧血的治療。最近研究發(fā)現(xiàn)，EPO是一種多功能的細(xì)胞因子，除了調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生成以增加組織供氧外，EPO還具有抗凋亡、抗炎、抗氧化、促進血管生成、促進細(xì)胞增值以及抗腫瘤等作用。
　　 國外研究報道，EPO能誘導(dǎo)血紅素加氧酶-1（Heme oxy genase-1，HO-1）表達(dá)增多，

3、減弱氧化應(yīng)激，減輕腎小管間質(zhì)損傷及巨噬細(xì)胞浸潤，發(fā)揮腎保護作用[2]。而在HO-1缺乏的培養(yǎng)基中培養(yǎng)腎小管上皮細(xì)胞菌株，腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化明顯增強，平滑肌肌動蛋白表達(dá)增加，加重了腎纖維化和腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化[3]。
　　 本研究以單側(cè)輸尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）大鼠模型為研究對象，觀察腎組織的病理改變，并檢測其血紅蛋白變化，應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法測定TGF-β1、α-SM

4、A、HO-1的表達(dá)與變化情況，并應(yīng)用重組人紅細(xì)胞生成素（recombinant human erythropoietin，rh-EPO）進行干預(yù)，從而進一步探討該藥物改善腎間質(zhì)纖維化的作用及其可能的機制，為臨床防治慢性腎臟病的進展提供實驗性理論依據(jù)。
　　 方法：清潔級健康雄性Wistar大鼠54只，體重（180±20）克，隨機分為三組：假手術(shù)組（A組），單側(cè)輸尿管結(jié)扎組（B組），rh-EPO干預(yù)組（C組），各18只。術(shù)后第3、

5、7、14天分批處死，又將每組隨機分為N3、N7、N14組，每組各6只。所有大鼠均在溫度（23±2）℃，相對濕度為（55±2）％下自由進食水，將B、C兩組大鼠以10％水合氯醛0.8～1ml腹腔注射麻醉后，脊柱左旁開0.5cm處切口，沿左腎下極尋找到左側(cè)輸尿管，在中上1/3處用4號線上下結(jié)扎兩處，然后從中剪斷輸尿管，以防逆行性感染，建立UUO大鼠模型。A組僅游離輸尿管但不結(jié)扎。術(shù)后各組大鼠均正常進食水。C組大鼠以rh-EPO300IU/Kg

6、（稀釋至0.5ml左右）皮下注射，1次/隔日；A和B組大鼠用等量生理鹽水皮下注射，1次/隔日，三組均于術(shù)前三天開始皮下注射（術(shù)前注射rh-EPO兩次）至術(shù)后第3天、7天、14天稱重后剪斷股動脈處死大鼠并留取血液標(biāo)本送檢，迅速取出左腎，按冠狀位縱行切開，取腎組織置于4％多聚甲醛固定液固定，石蠟包埋，分別制成3μm和5μm切片。光鏡下HE、Masson染色觀察腎組織病理變化，采用免疫組織化學(xué)染色測定腎小管間質(zhì)HO-1、α-SMA、TGF-β

7、1的表達(dá)，結(jié)果應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)進行半定量分析。實驗結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，各組間比較采用單因素方差分析，應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理，P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：1、大體觀察：可見A組腎臟大小形態(tài)正常，顏色暗紅；B、C兩組梗阻側(cè)腎臟第3天明顯腫大，顏色變淺，有囊性感，內(nèi)含褐色混濁液體，腎實質(zhì)變薄，腎盂擴張，腎盞乳頭受壓，穹窿部乳頭變平鈍，部分成凹形，乳頭萎縮。隨著時間的延長，

8、上述變化更加明顯。2、HE染色結(jié)果顯示：A組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)未見異常變化。B組大鼠術(shù)后3天出現(xiàn)腎小管輕度擴張，間質(zhì)中少量單核細(xì)胞與淋巴細(xì)胞浸潤；7天可見腎小管擴張明顯，上皮細(xì)胞變性、水腫、甚至壞死，腎間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤增多，間質(zhì)寬度明顯增加，偶見萎縮腎小管；14天上述病變加重，可見彌漫的腎小管基底膜增厚皺縮，小管基底膜不同程度斷裂，皮質(zhì)及外髓萎縮的腎小管較多，間質(zhì)中淋巴單核細(xì)胞浸潤、纖維化較明顯。與同期B組相比，C組大鼠腎小管擴張、間質(zhì)中單

9、核細(xì)胞與淋巴細(xì)胞浸潤的程度明顯下降，結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與同期A組相比，C組大鼠腎小管擴張、間質(zhì)中單核細(xì)胞與淋巴細(xì)胞浸潤的程度仍較高（P<0.05）。3、Masson染色顯示：A組大鼠腎小管間質(zhì)內(nèi)未見明顯異常。隨時間延長B組大鼠腎小管擴張，腎間質(zhì)寬度增加，膠原纖維增加，染色加深，與同期B組比較，C組大鼠腎小管間質(zhì)纖維化程度明顯減少（P<0.05），但其腎小管間質(zhì)纖維化程度仍高于同期A組（P<0.05）。4、血常規(guī)檢測結(jié)果：

10、治療組血紅蛋白值與模型組及假手術(shù)組相比，差別無顯著性意義（P>0.05）。5、免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：在假手術(shù)組，HO-1、α-SMA、TGF-β1均在腎小管上皮細(xì)胞中有少量表達(dá)；在B組和C組中，隨著梗阻時間的延長，HO-1的表達(dá)均明顯降低，但這兩組各時相點HO-1的表達(dá)均明顯高于A組（P<0.05）；與B組相比，C組中HO-1的表達(dá)在各時相點明顯增高（P<0.05）。B組和C組中，α-SMA、TGF-β1于各時相點隨梗阻時間的延長升高程

11、度更加明顯，至14天表達(dá)最強，C組較B組同時相點的表達(dá)均明顯降低（P<0.05），但這兩組各時相點均明顯高于A組（P<0.05）。除A組組內(nèi)三種因子的表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)意義外（P>0.05），三組中組內(nèi)與組間比較均有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。
　　 結(jié)論：1、單側(cè)輸尿管梗阻大鼠，隨著梗阻時間的延長，可見腎間質(zhì)中炎性細(xì)胞浸潤，腎小管不斷擴張、萎縮、壞死，腎間質(zhì)相對面積增寬，腎間質(zhì)纖維化加重；腎間質(zhì)HO-1表達(dá)下降，TGF-β1、α-S