RNA干擾抑制胸膜間皮細(xì)胞水通道蛋白-1表達(dá)的體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：胸腔積液是一種常見(jiàn)的病理狀態(tài)。水通道蛋白(AQPs)是具有選擇性水通道的同源跨膜蛋白質(zhì)家族，參與多種細(xì)胞膜液體轉(zhuǎn)運(yùn)?，F(xiàn)在已從哺乳動(dòng)物組織中鑒定出13種水通道蛋白，每種水通道蛋白都能夠提高細(xì)胞膜的水通透性，提供快速液體轉(zhuǎn)運(yùn)的途徑。水通道蛋白-1(AQP-1)廣泛分布于體內(nèi)，選擇性分布在與液體吸收或分泌有關(guān)的上皮細(xì)胞及可能協(xié)同水跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)的內(nèi)皮細(xì)胞中，參與各種體液的生成和吸收。隨著對(duì)水通道蛋白的逐步認(rèn)識(shí)，水通道蛋白與多種臨床疾病液

2、體轉(zhuǎn)運(yùn)的相關(guān)性近年來(lái)已得到重視，為研究胸水轉(zhuǎn)運(yùn)的分子機(jī)制提供了新的角度。但是迄今為止，由于缺乏特異性AQP-1藥物抑制劑，且傳統(tǒng)的基因敲除由于操作費(fèi)時(shí)、費(fèi)用昂貴、成功率低等因素均妨礙了AQP-1參與胸水轉(zhuǎn)運(yùn)的直接研究。RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)作為一種新的反向遺傳學(xué)手段，已引起人們的廣泛關(guān)注。RNA干擾可以代替基因敲除，提供一種經(jīng)濟(jì)、快捷、高效、特異地阻斷基因表達(dá)的技術(shù)手段，為功能基因組學(xué)及基因治療的研

3、究開(kāi)辟一條新思路。 第一部分水通道蛋白-1在炎癥性胸腔積液大鼠胸膜上表達(dá)及相關(guān)性研究. 一、目的:探討水通道蛋白-1(AQP-1)在炎癥性胸腔積液大鼠胸膜上的表達(dá)及其與胸水形成的相互關(guān)系。 二、方法: 56只健康Wistar大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和胸膜炎組。對(duì)照組胸腔內(nèi)注入生理鹽水，而胸膜炎組采用角叉菜膠胸腔內(nèi)注射建立炎癥性胸腔積液大鼠模型；對(duì)照組于胸腔內(nèi)注入生理鹽水后24h處死，而胸膜炎組則于胸腔內(nèi)注入角叉

4、菜膠6h、12h、24h、36h、48h和72h后處死，每組各8只，應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)AQP-1在大鼠胸膜上的分布；RT-PCR、Western blot方法分別在mRNA和蛋白質(zhì)水平檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組大鼠臟、壁層胸膜AQP-1表達(dá)的變化，同時(shí)測(cè)定各實(shí)驗(yàn)組大鼠胸腔積液量。 三、結(jié)果: 免疫組化顯示：AQP-1主要表達(dá)在臟、壁層胸膜間皮細(xì)胞，6h、12h、24h、36h、48h和72h胸膜炎組胸水量分別為2.10±0.22

5、ml、4.10±0.15ml、4.40±0.36ml、3.20±0.27ml、2.60±0.18ml、0.12±0.02ml。胸膜炎各時(shí)相組臟、壁層胸膜AQP-1表達(dá)均增強(qiáng)。胸膜炎組AQP-1-mRNA表達(dá)量(積分吸光度)：壁層胸膜：6h開(kāi)始升高，24h達(dá)高峰(12.32±1.23)，比對(duì)照組(3.38±0.27)明顯升高(P<0.01)，臟層胸膜：12h開(kāi)始升高，24h達(dá)高峰(26.65±1.62)，比對(duì)照組(6.24±0.54)明顯

6、升高(P<0.01)；AQP-1蛋白表達(dá)量(積分吸光度)：壁層胸膜：6h開(kāi)始升高，24h達(dá)高峰(68.72±6.92)，與對(duì)照組(21.04±1.84)比較明顯升高(P<0.01)；臟層胸膜：AQP-1表達(dá)12h開(kāi)始升高，24h達(dá)高峰(240.11±21.63)，與對(duì)照組(86.84±7.19)比較明顯升高(P<0.05)，然后逐漸降低，但仍高于正常對(duì)照組；AQP-1蛋白表達(dá)增強(qiáng)的時(shí)間與胸腔積液量基本一致。 四、結(jié)論:胸膜間皮細(xì)

7、胞存在AQP-1表達(dá)，胸膜炎胸腔積液時(shí)胸膜.AQP-1表達(dá)增強(qiáng)，AQP-1可能參與炎癥性胸腔積液的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程。 第二部分質(zhì)粒表達(dá)型shRNA抑制胸膜間皮細(xì)胞水通道蛋白-1表達(dá)的體外實(shí)驗(yàn). 一、目的:1.觀(guān)察大鼠胸膜間皮細(xì)胞水通道蛋白-1(AQP-1)的表達(dá)； 2.構(gòu)建針對(duì)AQP-1基因的AQP-1-pGenesil-1表達(dá)質(zhì)粒； 3.觀(guān)察AQP-1-pGenesil-1質(zhì)粒對(duì)AQP-1表達(dá)的特異性抑制作用，

8、為進(jìn)一步應(yīng)用該技術(shù)治療胸腔積液的可行性奠定基礎(chǔ)。 二、方法: 體外原代培養(yǎng)大鼠胸膜間皮細(xì)胞，細(xì)胞鑒定后，采用免疫細(xì)胞化學(xué)、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法檢測(cè)AQP-1表達(dá)；設(shè)計(jì)合成2對(duì)靶向大鼠AQP-1基因的siP(NA，構(gòu)建重組AQP-1-1-pGenesil-1和AQP-1-2-pGenesil-1質(zhì)粒，酶切鑒定。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染大鼠胸膜間皮細(xì)胞48h后，應(yīng)用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，采用RT-PCR及

9、Western blot方法分別在mRNA和蛋白質(zhì)水平檢測(cè)AQP-1基因表達(dá)的抑制效果。 三、結(jié)果: 發(fā)現(xiàn)胸膜間皮細(xì)胞存在AQP-1表達(dá)，所設(shè)計(jì)的質(zhì)粒AQP-1-1-pGenesil-1和AQP-1-2-pGenesil-1經(jīng)酶切鑒定與DNA測(cè)序證實(shí)構(gòu)建成功。說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)已成功構(gòu)建了針對(duì)AQP-1基因的AQP-1-pGenesil-1重組質(zhì)粒。AQP-1-pGenesil-1與IApofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染比

10、例為1：2.5時(shí)，GFP表達(dá)最強(qiáng)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率為42％，重組質(zhì)粒可不同程度的抑制AQP-1在胸膜間皮細(xì)胞中的表達(dá)，在mRNA水平抑制率分別為：83.45％和90.93％；在蛋白質(zhì)水平抑制率分別為：41.24％和67.60％，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。 四、結(jié)論:質(zhì)粒介導(dǎo)的RNAi可明顯抑制大鼠胸膜間皮細(xì)胞AQP-1基因的表達(dá)，且抑制率具有序列相關(guān)性，是潛在的胸腔積液基因治療新方法。

11、 第三部分高滲液和地塞米松對(duì)胸膜間皮細(xì)胞水通道蛋白-1表達(dá)的影響. 一、目的觀(guān)察胸膜間皮細(xì)胞水通道蛋白-1(AQP-1)的表達(dá)及高滲狀態(tài)、地塞米松(Dex)對(duì)其表達(dá)的影響，為進(jìn)一步研究胸水治療的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 二、方法: 體外原代培養(yǎng)Wistar大鼠胸膜間皮細(xì)胞，細(xì)胞鑒定后，采用免疫細(xì)胞化學(xué)、RT-PCR方法檢測(cè)AQP-1表達(dá)。高滲液對(duì)AQP-1表達(dá)的影響：細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、高滲組和高滲時(shí)間組，對(duì)照組以正常

12、培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞，高滲組以含不同濃度NaCI的高滲培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞24h；高滲時(shí)間組以含100mmol/L NaCI高滲培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞6h、12h、18h、24h，建立胸膜間皮細(xì)胞對(duì)高滲液反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，?yīng)用Western blot、RT-PCR方法檢測(cè)細(xì)胞中AQP-1表達(dá)變化規(guī)律。地塞米松(Dex)對(duì)AQP-1表達(dá)的影響：應(yīng)用Western blot方法檢測(cè)以不同濃度Dex(10<'-8>，10<'-7>，10<'-6>，10<'-5

13、>，10<'-4>mmol/L)處理細(xì)胞24h及以10<'-4>mmol/L Dex處理細(xì)胞6h、12h、24h、36h、48h、72h后AQP-1表達(dá)情況。 三、結(jié)果: 發(fā)現(xiàn)胸膜間皮細(xì)胞存在AQP-1表達(dá)。含25、50、75、100、150mmol/L NaCI高滲培養(yǎng)液作用于胸膜間皮細(xì)胞24h后，AQP-1蛋白表達(dá)量(積分吸光度)分別為24.04±1.81，27.84±2.41，31.68±2.53，89.74±6.

14、20，107.66±9.32，分別高于正常對(duì)照組(10.80±1.46)2.23，2.56，2.93，8.31，9.97倍(P<0.01)，AQP-1表達(dá)與滲透壓相關(guān)；對(duì)照組用正常培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞6h、12h、18h、24 h后，AQP-1表達(dá)無(wú)明顯差異(P>0.05)。在相同的作用時(shí)間條件下，以100mmol/LNaCI高滲液培養(yǎng)細(xì)胞，AQP-1蛋白表達(dá)量分別為：42.08±2.57，78.88+3.62，109.61±7.62， 12

15、3.41±8.65，分別高于正常對(duì)照組(12.91±1.92)3.26，6.11，8.49，9.56倍，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，AQP-1表達(dá)與作用時(shí)間相關(guān)。AQP-1在mRNA水平表達(dá)與蛋白水平表達(dá)相一致。以10<'-8>，10<'-7>，10<'-6>，10<'-5>，10<'-4>mmol/L Dex干預(yù)胸膜間皮細(xì)胞24h后，AQP-1蛋白表達(dá)量(積分吸光度)分別為755.04±19.81，843.72±19.41，8

16、62.96±26.53，694.80±32.00，938.08±13.32，分別高于正常對(duì)照組(372.90±16.46)2.02，2.26，2.31，1.86，2.52倍(P<0.01)，AQP-1表達(dá)升高與地塞米松濃度無(wú)關(guān)；以10<'-4>mmol/LDex干預(yù)細(xì)胞6h，12h，24h，36h，48h，72h后，AQP-1蛋白表達(dá)量分別為：554.14±23.57，917.78±38.62，1 587.20±61.22，1 322.

17、09±28.65，918.40±26.62，1117.60±51.32，分別高于正常對(duì)照組(495.91±23.12)1.12，1.85，3.20，2.67，1.85，2.25倍(P<0.01)，AQP-1表達(dá)與地塞米松作用時(shí)間有關(guān)。 四、結(jié)論:胸膜問(wèn)皮細(xì)胞存在AQP-1表達(dá)，高滲液上調(diào)胸膜間皮細(xì)胞AQP-1表達(dá)，且與滲透壓及作用時(shí)間相關(guān)，AQP-1可能參與胸水的轉(zhuǎn)運(yùn)。地塞米松對(duì)胸膜間皮細(xì)胞AQP-1表達(dá)有明顯的增強(qiáng)性調(diào)節(jié)作用，