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文檔簡介
1、研究背景和目的:
嚴重燒傷后,由于應激刺激,神經(jīng)、體液和內(nèi)分泌紊亂,體內(nèi)常有致炎因子釋放,容易引起局部或全身的炎癥反應(inflammation)。炎癥反應發(fā)生后,炎性細胞又被進一步激活,細胞和體液均可釋放大量的炎癥介質(zhì),通過直接損傷血管內(nèi)皮細胞或間接影響其它化學因子而最終引起血管通透性的增高。作為人體與外界溝通的重要門戶,肺在嚴重燒傷后,極易受到多種因素影響而引起肺微血管通透性增高,導致肺微血管內(nèi)皮細胞屏障破壞,進而引起急性
2、肺損傷(acute lung injury,ALI)的發(fā)生。截至目前,臨床尚無有效降低血管通透性的方法,對于炎癥導致肺微血管通透性增高的機制我們也依然不清楚。
近年來,大量研究結(jié)果提示,微管(microtubule,MT)作為細胞骨架系統(tǒng)的重要成分,在內(nèi)皮細胞通透性的調(diào)節(jié)中具有舉足輕重的地位,而微管的穩(wěn)定受到其它多種因素的影響,例如GTP、溫度、藥物、微管相關(guān)蛋白等。相關(guān)研究表明,微管解聚可以引起細胞形態(tài)、細胞間連接結(jié)構(gòu)等一系
3、列改變,造成細胞不可逆的損傷。而微管穩(wěn)定劑則可穩(wěn)定微管,抑制這些破壞作用的發(fā)生。但是在炎癥條件下,微管是如何參與并調(diào)節(jié)人肺微血管內(nèi)皮細胞(human pulmonary microvascular endothelial cells,HPMECs)通透性的增高,我們尚不清楚。
因此,本研究將檢測MAP4在炎癥時的活性變化情況,并且通過構(gòu)建MAP4突變體MAP4(Ala),模擬MAP4的去磷酸化狀態(tài),通過瞬時轉(zhuǎn)染重組腺病毒,進一
4、步明確MAP4磷酸化是否介導炎癥引起的HPMECs通透性增高。在此基礎(chǔ)之上,我們還將初步探索MAP4參與調(diào)節(jié)炎癥導致HPMECs通透性增高的相關(guān)機制。旨在為臨床相關(guān)疾病的治療提供新的靶點和研究方向。
材料和方法:
1、我們以HPMECs為研究對象,利用致炎因子脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)和腫瘤壞死因子-α(tumour necrosis factor-α)處理細胞,模擬體外炎癥刺激。觀察致炎
5、因子LPS(200、500、1000ng/ml)和TNF-α(200、500、1000ng/ml)處理前后,HPMECs通透性及微管的變化情況,并采用以下方法進行相應檢測和觀察:1)檢測FITC-dextran(40kDa)熒光物質(zhì)漏出情況和測量跨內(nèi)皮細胞電阻值(TER),以此觀察肺微血管內(nèi)皮細胞屏障功能的改變狀況;2)對α-微管蛋白進行免疫熒光染色(Immunofluorescence,IF),以此觀察微管的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和分布狀況;3)
6、將游離態(tài)與聚合態(tài)的微管蛋白分離、提取并定量,采用Western blot(WB)方法進行檢測,觀察游離態(tài)與聚合態(tài)微管蛋白含量的變化情況。
2、使用微管穩(wěn)定劑紫杉醇(taxol,luM)預處理細胞,觀察紫杉醇預處理前后,致炎因子LPS(500ng/ml)和TNF-α(500ng/ml)刺激對HPMECs通透性和微管的影響。通過檢測FITC-dextran和TER,來觀察肺微血管內(nèi)皮細胞單層通透性的改變情況;采用IF法觀察微管的形
7、態(tài)、結(jié)構(gòu)和分布的改變;分離并提取游離態(tài)和聚合態(tài)的微管蛋白,通過WB檢測其含量的變化。
3、通過WB進行檢測,觀察致炎因子LPS(500ng/ml)和TNF-α(500ng/ml)處理HPMECs1h、3h、6h、12h后,MAP4活性的變化情況。構(gòu)建模擬MAP4去磷酸化狀態(tài)的突變體MAP4(Ala),瞬時轉(zhuǎn)染HPMECs72h,通過測量FITC-dextran熒光漏出和TER,觀察轉(zhuǎn)染前后,致炎因子LPS(500ng/ml)和
8、TNF-α(500ng/ml)刺激對HPMECs通透性的影響,并采用IF法檢測微管的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和分布狀況,同時分離提取聚合態(tài)與游離態(tài)的微管蛋白,通過WB法檢測其含量的改變,另外,使用免疫共沉淀(Immunoprecipitation,IP)檢測MAP4與微管間的相互作用情況,以此明確MAP4在調(diào)節(jié)HPMECs通透性和微管改變中發(fā)揮的作用。
結(jié)果:
1、致炎因子LPS(200、500、1000ng/ml)或TNF-α(
9、200、500、1000ng/ml)處理HPMECs6h后,HPMECs單層對FITC-dextran熒光物質(zhì)漏出增多,跨內(nèi)皮細胞電阻值降低,并且呈劑量依賴性改變;致炎因子LPS或TNF-α刺激濃度為200ng/ml時,微管結(jié)構(gòu)不規(guī)則,少量微管斷裂; LPS或TNF-α刺激濃度為500ng/ml時,細胞膜周微管解聚明顯,細胞核周微管皺縮;當LPS或TNF-α刺激濃度增至1000ng/ml時,只殘留極少的微管結(jié)構(gòu)和片段;游離/聚合態(tài)微管蛋
10、白定量檢測提示,致炎因子LPS(200、500、1000ng/ml)或TNF-α(200、500、1000ng/ml)處理后,游離態(tài)微管蛋白增多而聚合態(tài)微管蛋白減少,并呈劑量依賴性改變。
2、根據(jù)上述實驗結(jié)果,選擇LPS(500ng/ml)或TNF-α(500ng/ml)兩個典型的致炎因子用于后續(xù)實驗。在微管穩(wěn)定劑紫杉醇(1uM)預處理細胞1h后,正常細胞通透性無明顯改變,微管聚合增加,解聚減少;同時,致炎因子LPS(500n
11、g/ml)或TNF-α(500ng/ml)刺激6h導致的FITC-dextran熒光物質(zhì)漏出明顯減少,跨內(nèi)皮細胞電阻值明顯增加;并且微管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)破壞減少,細胞膜周微管密度增加;聚合態(tài)微管蛋白含量增加,游離態(tài)微管蛋白含量減少。
3、致炎因子LPS(500ng/ml)或TNF-α(500ng/ml)處理HPMECs6h后,MAP4(S696與S787)磷酸化增高,而MAP4(Ser768)磷酸化無改變。轉(zhuǎn)染MAP4(Ala)干預M
12、AP4磷酸化后,正常HPMECs通透性無明顯改變,微管聚合增加,解聚減少;同時,致炎因子LPS(500ng/ml)或TNF-α(500ng/ml)刺激6h后的HPMECs單層對FITC-dextran熒光物質(zhì)漏出明顯減少,跨內(nèi)皮細胞電阻值明顯升高;而且微管的動力學更加穩(wěn)定,微管的結(jié)構(gòu)得到改善,游離態(tài)的微管含量減少而聚合態(tài)微管蛋白增多;此外,MAP4與微管之間的相互結(jié)合也增多。
結(jié)論:
致炎因子LPS或TNF-α處理H
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