血小板活化因子對大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞Src抑制的蛋白激酶C底物基因表達的影響.pdf

1、目的：研究血小板活化因子（PAF）對培養(yǎng)的大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞（RPMVEC）中Src抑制的蛋白激酶C底物（SSeCKS）mRNA表達的影響，觀察信號通路抑制劑對炎癥介導SSeCKS mRNA表達的干預作用，結合我們既往的工作進一步探討PAF參與急性肺損傷（ALI）發(fā)生的機制，并初步開展SSeCKS在炎癥誘導RPMVEC損傷過程中基因表達的信號轉導途徑研究。
　　 方法：體外分離培養(yǎng)RPMVEC；建立RPMVEC中SSeCKS

2、mRNA表達的原位雜交檢測方法；根據(jù)PAF刺激時間和濃度的差異將RPMVEC隨機分為PAF量效組和時效組：量效組分別以10-10、10-9、10-8、10-7 mol/L PAF與RPMVEC作用 1.5h，時效組以10-7 mol/L PAF與RPMVEC分別作用0.5、1.5、3、6、12、24 h；信號通路抑制劑干預：RPMVEC與10 μmol/L核轉錄因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）抑制劑吡咯烷二巰

3、基氨甲酸（pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC）預孵育1 h或10 μmol/L蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）抑制劑雙吲哚基順丁烯二酰亞胺（bis-indolylmaleimide，BIM）預孵育0.5h，再與10-7 mol/L PAF或10 mg/L脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）作用1.5h，以上均設正常、陰性和陽性對照組；原位雜交技術（in situ hy

4、bridization，ISH）與計算機圖像分析系統(tǒng)軟件結合運用檢測不同條件下RPMVEC中SSeCKS mRNA的表達變化。
　　 結果：⑴體外成功進行RPMVEC的分離培養(yǎng)，并經(jīng)形態(tài)學及FITC-BSI結合實驗證實。⑵成功建立經(jīng)地高辛標記的寡核苷酸探針原位雜交檢測RPMVEC中SSeCKS mRNA的實驗方法。⑶正常RPMVEC有 SSeCKS mRNA少量表達，為棕黃色細顆粒狀雜交信號，分布于胞質(zhì)。10-10、10-9、1

5、0-8、10-7 mol/L PAF分別孵育RPMVEC 1.5h，SSeCKS mRNA表達量隨其濃度增加而逐漸升高，與正常對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義。10-7 mol/L PAF刺激RPMVEC 0.5h，SSeCKS mRNA表達水平即顯著升高，1.5h達峰值，之后逐漸下降，至24 h仍高于正常對照組。⑷PDTC可顯著下調(diào)PAF或LPS對RPMVEC中SSeCKS mRNA的誘導效應，而BIM對此效應無干預作用。