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文檔簡介
1、目的:研究血小板活化因子(PAF)對培養(yǎng)的大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞(RPMVEC)中Src抑制的蛋白激酶C底物(SSeCKS)mRNA表達的影響,觀察信號通路抑制劑對炎癥介導SSeCKS mRNA表達的干預作用,結合我們既往的工作進一步探討PAF參與急性肺損傷(ALI)發(fā)生的機制,并初步開展SSeCKS在炎癥誘導RPMVEC損傷過程中基因表達的信號轉導途徑研究。
方法:體外分離培養(yǎng)RPMVEC;建立RPMVEC中SSeCKS
2、mRNA表達的原位雜交檢測方法;根據(jù)PAF刺激時間和濃度的差異將RPMVEC隨機分為PAF量效組和時效組:量效組分別以10-10、10-9、10-8、10-7 mol/L PAF與RPMVEC作用 1.5h,時效組以10-7 mol/L PAF與RPMVEC分別作用0.5、1.5、3、6、12、24 h;信號通路抑制劑干預:RPMVEC與10 μmol/L核轉錄因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)抑制劑吡咯烷二巰
3、基氨甲酸(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)預孵育1 h或10 μmol/L蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)抑制劑雙吲哚基順丁烯二酰亞胺(bis-indolylmaleimide,BIM)預孵育0.5h,再與10-7 mol/L PAF或10 mg/L脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)作用1.5h,以上均設正常、陰性和陽性對照組;原位雜交技術(in situ hy
4、bridization,ISH)與計算機圖像分析系統(tǒng)軟件結合運用檢測不同條件下RPMVEC中SSeCKS mRNA的表達變化。
結果:⑴體外成功進行RPMVEC的分離培養(yǎng),并經(jīng)形態(tài)學及FITC-BSI結合實驗證實。⑵成功建立經(jīng)地高辛標記的寡核苷酸探針原位雜交檢測RPMVEC中SSeCKS mRNA的實驗方法。⑶正常RPMVEC有 SSeCKS mRNA少量表達,為棕黃色細顆粒狀雜交信號,分布于胞質(zhì)。10-10、10-9、1
5、0-8、10-7 mol/L PAF分別孵育RPMVEC 1.5h,SSeCKS mRNA表達量隨其濃度增加而逐漸升高,與正常對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義。10-7 mol/L PAF刺激RPMVEC 0.5h,SSeCKS mRNA表達水平即顯著升高,1.5h達峰值,之后逐漸下降,至24 h仍高于正常對照組。⑷PDTC可顯著下調(diào)PAF或LPS對RPMVEC中SSeCKS mRNA的誘導效應,而BIM對此效應無干預作用。
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