應(yīng)用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面抗體展示技術(shù)構(gòu)建登革病毒特異性全長人源抗體庫.pdf

1、抗體(antibody)是人類免疫系統(tǒng)的重要組成部分，為機(jī)體提供有效的免疫防護(hù)。近二十年來，抗體在許多領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛，包括環(huán)境監(jiān)測，臨床檢測及疾病治療等。隨著現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，所獲得的單克隆抗體種類大大增加、臨床應(yīng)用的副作用有了顯著改善。
　　 單克隆抗體制備技術(shù)出現(xiàn)于上世紀(jì)七十年代。通過雜交瘤技術(shù)獲得的抗體是鼠源性的抗體，用于臨床治療時(shí)會存在誘發(fā)人抗鼠抗體反應(yīng)（human anti-mouseantibody，H

2、AMA）的可能性，并且安全性較差。其應(yīng)用價(jià)值在一段時(shí)間里一直備受討論。隨著現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，所獲得的單克隆抗體種類大大增加、副作用有了顯著改善?？贵w越來越廣泛的被利用，包括臨床治療及檢測、環(huán)境監(jiān)測等。單克隆抗體的制備技術(shù)先后經(jīng)歷了雜交瘤技術(shù)、抗體庫技術(shù)、抗體展示及篩選技術(shù)等多個(gè)發(fā)展階段。目前較為常用的噬菌體展示等技術(shù)，有著實(shí)驗(yàn)過程簡單，庫容量大等優(yōu)點(diǎn)。但是由于噬菌體展示技術(shù)一般只能篩選抗原結(jié)合片段(Fragment of ant

3、igen binding，F(xiàn)ab)或單鏈可變區(qū)抗體片段(single chainvariable Fragment，scFv)等小分子，所以不能通過噬菌體展示技術(shù)篩選得到全長的人源抗體;另外，展示系統(tǒng)所使用的宿主細(xì)胞為原核細(xì)胞，原核細(xì)胞在表達(dá)蛋白過程中的密碼子與真核細(xì)胞不同，因此大噬菌體展示技術(shù)篩選獲得的全長抗體很難在哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中獲得高表達(dá)。而利用現(xiàn)有的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面展示技術(shù)所建立的全長抗體庫的庫容量僅為106，不足以滿足篩選出高特

4、異性抗體的需求;若能夠提升抗體庫的構(gòu)建效率，建立大容量的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面展示全長抗體庫，將有利于從中篩選獲得高特異性、高親和力的抗體，從而推動(dòng)抗體研究的進(jìn)步。
　　 登革病毒感染可引起登革熱(DF)、登革出血熱(DHF)和登革休克綜合癥(DSS)。DHF/DSS病情嚴(yán)重，致死率高。因?yàn)槠涓腥緳C(jī)制較為復(fù)雜，目前尚未行之有效的臨床針對性治療。又因?yàn)槠溆晌妹絺鞑ルy以控制，同時(shí)缺乏有效的登革疫苗。因此，對篩選出高特異性的登革抗體，不僅是

5、運(yùn)用于臨床治療藥物的開發(fā)還是用于疫苗的研制，都有非常重要的作用。甚至對其發(fā)病機(jī)理的發(fā)現(xiàn)，都將大有幫助。
　　 本研究使用課題組前期構(gòu)建成功的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體pDGB-HC-TM，通過將全長抗體基因插入載體中，再展示在哺乳動(dòng)物CHO細(xì)胞表面，為以后篩選較理想高特異性登革抗體做鋪墊。通過流式分析得到的結(jié)果，8個(gè)輕鏈克隆、7個(gè)重鏈克隆均可檢測到抗體的表達(dá)，細(xì)胞陽性率2.8％-41.3％，這與抗體庫基因測序結(jié)果相一致。理論上獲得的抗

6、體多樣性達(dá)到1.46×109[(1.45×104×80％)×(1.8×105×70％)]。從流式分析結(jié)果來看，在沒有轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的陰性對照組，CHO細(xì)胞背景陽性率只有0.2％，而轉(zhuǎn)染有高效表達(dá)的載體陽性對照組，CHO細(xì)胞表達(dá)達(dá)到37.7％，這說明CHO細(xì)胞可以作為很好的展示平臺。隨后將輕鏈抗體基因和重鏈抗體基因同時(shí)插入到哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體pDGB4中，構(gòu)建登革病毒全長人源二級抗體基因庫，庫容量為2.4×105，背景克隆的比例為1.2％。將

7、其瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，陽性組為12％，而本研究所建立的登革病毒全長人源二級抗體基因庫中有最高有19％的細(xì)胞表面成功展示全長抗體并被檢查到。
　　 一、登革病毒特異性全長人源抗體庫的構(gòu)建
　　 目的：應(yīng)用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面抗體展示技術(shù)構(gòu)建登革病毒特異性全長人源抗體庫。
　　 方法：
　　 1.外周血淋巴細(xì)胞的分離及總RNA的提取采集確診的登革熱患者恢復(fù)期靜脈血20ml，置于抗凝管中，采用密

8、度梯度離心法分離外周血單核細(xì)胞，加入適量Buffer RLT，裂解細(xì)胞，-80℃冰箱保存?zhèn)溆没蛘咧苯佑糜谔崛】俁NA。
　　 2.cDNA第一鏈的合成以提取的總RNA為模板，使用輕鏈全長引物和重鏈可變區(qū)引物，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈。
　　 3.全套IgG1重鏈可變區(qū)基因和輕鏈κ型全長基因的擴(kuò)增以合成的cDNA為模板，用相應(yīng)的特異性引物擴(kuò)增全套IgG1輕鏈κ型全長基因及全套IgG1重鏈可變區(qū)基因（3套輕鏈引物，3套重鏈

9、引物）。PCR條件為:94℃預(yù)變性5min，然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增(94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min)，隨后在延長溫度下反應(yīng)7min，以確保全長目的片段的合成。
　　 4.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分離純化PCR產(chǎn)物用1％的瓊脂糖凝膠電泳分離純化目的片段。然后將回收得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，再次經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳后回收目的片段備用。并用同樣方法處理3組輕鏈PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
　　 5.重鏈抗體基因庫及輕鏈

10、基因庫的構(gòu)建及鑒定以BsmBI對重鏈基因擴(kuò)增產(chǎn)物及載體pDGB-HC-TM進(jìn)行酶切，電泳分離純化目的片段，將回收的載體片段和抗體基因片段用T4 DNA連接酶按1∶1比例混合連接，在16℃反應(yīng)24h后導(dǎo)入化學(xué)轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH-5α，構(gòu)建重鏈基因庫。
　　 輕鏈全長基因的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)SfiI酶切后回收，與同樣經(jīng)SfiI酶切回收的載體pDGB-HC-TM片段用T4 DNA連接酶按1∶1比例混合連接，在16℃反應(yīng)24h后導(dǎo)入化學(xué)轉(zhuǎn)化

11、感受態(tài)大腸桿菌DH-5α，構(gòu)建輕鏈基因庫。
　　 分別從重鏈抗體庫和輕鏈抗體庫中各隨機(jī)挑取10個(gè)單克隆，搖菌培養(yǎng)過夜后抽提質(zhì)粒，測序分析抗體基因庫的質(zhì)量及多樣性。
　　 6.抗體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面的展示將8個(gè)輕鏈克隆與經(jīng)鑒定可以高效表達(dá)重鏈的載體pDGB-HC-TM共轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，同時(shí)將7個(gè)重鏈克隆分別與經(jīng)鑒定可以高效表達(dá)輕鏈的載體pDGB-Hu-Kappa共轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞。然后用流式分析儀檢測分析在CHO細(xì)胞表面表達(dá)

12、抗體的情況。
　　 結(jié)果與討論：
　　 我們分別構(gòu)建了登革病毒抗體輕鏈基因庫和重鏈基因庫。重鏈基因庫實(shí)驗(yàn)組的連接轉(zhuǎn)化效率為每微克DNA有1.4×106克隆，無插入片段的背景克隆為0.5％;輕鏈基因庫實(shí)驗(yàn)組的連接轉(zhuǎn)化效率為每微克DNA有1×106克隆，無插入片段的背景克隆為1.4％。分別用100ng的重鏈連接產(chǎn)物和100ng的輕鏈連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌，構(gòu)建獲得的輕鏈基因庫容量為1.45×104，重鏈基因庫容量為1.8×1

13、05。在抗體基因庫里的重鏈庫和輕鏈庫中各挑取10個(gè)單克隆進(jìn)行測序分析，結(jié)果表明重鏈庫的10個(gè)單克隆中有8個(gè)含有正確的VH編碼序列，編碼8個(gè)特異的氨基酸序列;輕鏈庫的10個(gè)單克隆中有7個(gè)含有正確的LCκ編碼序列，編碼7個(gè)特異的氨基酸序列。將此重鏈庫和輕鏈庫共轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞后，理論上抗體庫的多樣性可以達(dá)到1.46×109[(1.45×104×80％)×(1.8×105×70％)]，可以滿足篩選高親和力、高特異性抗體的要求。將抗體庫瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

14、CHO細(xì)胞后，在37％的細(xì)胞表面可以檢測到全長人源抗體的表達(dá)。
　　 結(jié)論：
　　 本研究采用哺乳動(dòng)物細(xì)胞展示技術(shù)，成功用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面展示載體pDGB-HC-TM構(gòu)建了庫容量大且多樣性好的全長人源抗體基因庫，可以滿足篩選高親和力、高特異性抗體的要求。
　　 二、登革病毒全長人源二級抗體庫的構(gòu)建及展示
　　 目的：
　　 將第一部分構(gòu)建好的登革病毒全長人源輕鏈、重鏈初級抗體基因庫的重鏈可變區(qū)及輕

15、鏈全長基因通過四片段連接插入哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體pDGB4，構(gòu)建一個(gè)全長人源的二級抗體庫，并將此抗體基因庫瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，全長抗體能夠在CHO細(xì)胞表面展示。
　　 方法：
　　 1.雙表達(dá)載體四GB4片段的制備
　　 用限制酶BsmBl和Sfil對載體pDGB4進(jìn)行雙酶切，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，分離純化5kb和3kb的兩段目的DNA片段。
　　 2.抗體庫基因的制備
　　 以第一部分已經(jīng)制

16、備的抗體重鏈基因庫的細(xì)菌沉淀為來源，進(jìn)行質(zhì)粒中提獲得抗體重鏈基因庫的質(zhì)粒DNA;用BsmBl進(jìn)行酶切，用1%瓊脂糖凝膠電泳分離純化0.45kb的目的DNA片段。
　　 以第一部分已經(jīng)制備的抗體輕鏈基因庫的細(xì)菌沉淀為來源，進(jìn)行質(zhì)粒中提獲得抗體輕鏈基因庫的質(zhì)粒DNA;用Sfil進(jìn)行酶切，用1%瓊脂糖凝膠電泳分離純化0.75kb的目的DNA片段。
　　 3.DNA片段的連接及感受態(tài)大腸桿菌DH-5α的轉(zhuǎn)化
　　 用T4

17、DNA連接酶將獲得的抗體輕、重鏈基因庫片段與純化得到的5kb和3kb的兩段載體DNA片段進(jìn)行連接，獲得重組pDGB4。轉(zhuǎn)化化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌DH-5α，構(gòu)建全長人源二級抗體庫。
　　 4.抗體庫在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面的展示
　　 將二級抗體庫的質(zhì)粒DNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，用PE標(biāo)記的鼠抗人kappa鏈抗體進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光染色，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測分析。
　　 結(jié)果與討論：
　　 根據(jù)在帶有氨芐青霉素抗性LB

18、平皿上長出的克隆數(shù)，計(jì)算所構(gòu)建的全長抗體二級基因庫庫容量為2.4×105，背景克隆的比例為1.2％。用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面可成功展示可被檢測的全長抗體?？偣蔡舫鰜?0個(gè)克隆，通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，共檢測到有4個(gè)克隆可以被檢測到在細(xì)胞表面表達(dá)抗體，陽性細(xì)胞比例從1.5％到19％不等，說明在同等實(shí)驗(yàn)條件下，不同的抗體分子在CHO細(xì)胞表面的表達(dá)強(qiáng)度不同。這可能是因?yàn)椴煌目贵w分子的氨基酸序列不同引起的表達(dá)差異，也可能是由于宿主細(xì)胞的活性有