從噬菌體scFv人源抗體庫(kù)中富集篩選抗Aβ抗體基因并初步鑒定.pdf

1、中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文從噬菌體scFv人源抗體庫(kù)中富集篩選抗Aβ抗體基因并初步鑒定姓名：劉喆申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：病理和病理生理學(xué)指導(dǎo)教師：梁平20060501中困協(xié)和醫(yī)科大學(xué)碩J：學(xué)位論文PCR鑒定，在約1050bp處出現(xiàn)預(yù)期片段。經(jīng)雙酶切鑒定，在約750bp處出現(xiàn)預(yù)期的片段。送測(cè)序后分析得到E6、F4的scFv基因序列，從中分別確定了vH與vL的DNA序列，經(jīng)過推導(dǎo)得到的特異單鏈抗體氨基酸序列具有相應(yīng)的人抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)

2、的典型特征，互補(bǔ)決定區(qū)和框架區(qū)的氨基酸序列被識(shí)別出來。然后將這兩株中結(jié)合活性較高的陽(yáng)性克隆F4的噬菌體顆粒上清感染EcoliHB2151，30℃，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)20h，分別制備胞周質(zhì)、培養(yǎng)基上清和全細(xì)胞提取物。經(jīng)12％SDSPAGE分析，目的蛋白相對(duì)分子量為30kD，主要集中于胞周質(zhì)中，表達(dá)量占全菌總蛋白10％左右，將此可溶形式的抗AB多肽scFv命名為s—F4。對(duì)F4周質(zhì)提取物進(jìn)行進(jìn)一步的檢測(cè)，ELISA(周質(zhì)提取物作一抗)檢測(cè)P／

3、N值)21，與BSA無交叉反應(yīng)，表明周質(zhì)提取物中存在sF4，并且能夠與Ap多肽發(fā)生特異性結(jié)合，sF4與AD多肽的結(jié)合反應(yīng)性O(shè)D490值約O474和展示在噬菌體表面的F4scFv抗體的A490值約O496基本一致。在westernblot(F4周質(zhì)提取蛋白作抗原)檢測(cè)中相應(yīng)位置約30kD出現(xiàn)特異條帶，但是F4周質(zhì)提取蛋白作抗體的westernblot卻未檢測(cè)到特異條帶。推測(cè)所篩選的s—F4識(shí)別的是非線性，構(gòu)象性的AB多肽抗原。本研究中從噬