牛傳染性胸膜肺炎診斷技術(shù)與分子流行病學(xué)研究.pdf

1、牛傳染性胸膜肺炎亦被稱為牛肺疫(Contagious boyine pleuropneumonia CBPP)是由絲狀支原體絲狀亞種SC生物型(Mycoplasma mycoides subsp.Mycoides SC MmmSC)引起的一種亞急性或慢性、接觸性傳染病，被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為A類傳染病。該病在20世紀(jì)20年代傳入我國，危害嚴(yán)重。從20世紀(jì)50年代我國開始大面積使用牛傳染性胸膜肺炎疫苗，有效地控制了該病在我國的流

2、行。我國雖然于1996年宣布消滅了牛肺疫，但由于沒有獲得國際認(rèn)證，國際社會也就不承認(rèn)我國已消滅牛肺疫。農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)局根據(jù)國際動物疫病流行趨勢和世界動物衛(wèi)生組織的相關(guān)工作計劃，從2002年開始在全國開展牛肺疫的流行病學(xué)監(jiān)測工作，為國際無病認(rèn)證做技術(shù)準(zhǔn)備。 在流行病學(xué)監(jiān)測工作中，血清流行病學(xué)資料是一個非常重要的方面。目前所應(yīng)用的OIE推薦的補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)方法(CFT)在基層推廣使用面臨很大的困難，而我國還沒有更好的診斷方法可以與CFT聯(lián)

3、合應(yīng)用，建立一種敏感、特異、方便基層應(yīng)用的血清學(xué)診斷方法將對血清流行病學(xué)監(jiān)測工作起到重要作用。在對CBPP血清陽性病例的診斷上，常規(guī)病原分離雖然仍是最有效的確認(rèn)手段，但快速、特異的病原檢測PCR方法已經(jīng)成為一種更加重要的技術(shù)手段，建立敏感、特異的PCR方法可以在最短時間內(nèi)進(jìn)行病原診斷，為病原分離提供依據(jù)。CBPP在我國流行雖有半個世紀(jì)之多，但關(guān)于該病的分子流行病學(xué)資料卻是一直是空白。根據(jù)記錄的流行病學(xué)資料，CBPP有可能通過兩種途徑傳入

4、中國，一種是通過我國與俄羅斯邊境牛只貿(mào)易，另一種是從澳大利亞引進(jìn)良種牛在上海入境后傳入我國。但根據(jù)MmmSC基因組和抗原性的不同，可以將其分成歐洲群和非洲-澳大利亞群，而這兩個基因群的菌株卻表現(xiàn)出不同的致病力和流行病學(xué)特征。那么究竟中國流行的MmmSC是歸屬于那一個基因群，其究竟是從何處傳入我國目前并不清楚。 在血清學(xué)診斷方法研究方面，由于lppQ基因和其編碼的脂蛋白LppQ(LipoproteinLppQ)存在于MmmSC非洲

5、株、歐洲株和疫苗株中，而在絲狀支原體簇的其他成員中未發(fā)現(xiàn)，沒有血清學(xué)交叉反應(yīng)，并且成熟的脂蛋白LppQ N末端是親水性的，在自然感染和人工感染時，特異性免疫反應(yīng)產(chǎn)生早，持續(xù)時間長，抗體滴度高，因此，LppQN末端基因編碼的蛋白是一種較為理想的CBPP診斷抗原。序列分析顯示，TGA密碼子在支原體中被編碼為色氨酸(Trp)，而在其他微生物中則為終止密碼子。本研究利用一步重疊延伸PCR突變方法體外誘變我國生產(chǎn)抗原用毒株HVRI X的lppQ基

6、因。序列分析表明將第198位的TGA成功突變?yōu)門GG，將突變后的脂蛋白LppQ N末端基因插入原核表達(dá)載體pgT32a的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建了脂蛋白LppQ N末端基因原核表達(dá)載體。表達(dá)后蛋白質(zhì)分子量約為42KD，帶有6個His標(biāo)簽，純化后蛋白質(zhì)純度為95％，Western-blot結(jié)果顯示具有很好的免疫活性。將純化的蛋白質(zhì)稀釋至0.33μg/ml包被酶標(biāo)板。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析后確定了判定標(biāo)準(zhǔn)：即樣本S/P大于0.5為陽性，小于0.4為陰性，兩者

7、之間為可疑。通過對100份CBPP高免血清和150份無牛肺疫血清的檢測結(jié)果表明，ELISA方法的敏感性為95％(95/100)，特異性為98％(147/150)。應(yīng)用間接ELISA和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(CFT)對來自3個省自治區(qū)3817頭份牛血清進(jìn)行了檢測，Kapaa值為0.701，兩種方法的存在中、高度一致。在病原診斷PCR方法研究方面，設(shè)計合成了MC1、MC2和SC1、SC2兩對引物。MC1、MC2是一對簇特異性引物，用于鑒別絲狀支原體簇

8、6個成員，對MmmSC、MmmLC擴(kuò)增出與預(yù)期結(jié)果相符的462bp片段；而SC1、SC2是針對MmmSC的一對特異性引物，只能對MmmSC擴(kuò)增出277bp的片段，經(jīng)過VspI、Bsp143I和DraI三種限制性內(nèi)切酶鑒定與預(yù)期結(jié)果相符，而不能擴(kuò)增出MmmLC型Y-goat代表株，說明具有非常好的特異性。對MmmSC進(jìn)行的敏感性試驗(yàn)顯示SC1、SC2引物能夠檢測到100個CFU，具有非常高的敏感性。利用該方法在新疆進(jìn)行了疑似肺臟的病原檢測

9、，共采集肺臟可疑樣品83份，PCR結(jié)果顯示均為陰性，與血清學(xué)檢測結(jié)果相符。 在分子流行病學(xué)研究方面，收集了6株來自中國不同地區(qū)歷史流行的MmmSC毒株與分離自非洲的MmmSC標(biāo)準(zhǔn)株P(guān)G1、MmmLC代表株Y-goat進(jìn)行分子特征比較。長片段PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示6株中國分離株與PG1、Y-goat都沒有缺失8.84kb片段。LppB基因及編碼的蛋白質(zhì)存在于所有的非洲群中，但在歐洲群中卻不存在。比較發(fā)現(xiàn)6株中國分離株LppB全基因序列

10、與PG1同源性達(dá)99％以上，而與Y-goat同源性小于93％。利用重組表達(dá)的PGl株LppB蛋白C端制備的抗血清在Western-blot試驗(yàn)中可以與PGl、Y-goat以及6株中國分離株在66kDa處發(fā)生雜交反應(yīng)，表明LppB基因及編碼蛋白質(zhì)存在于6株中國分離株中。利用多重序列分析試驗(yàn)(multilocus sequence analysis MLSA)對包括6株中國分離株在內(nèi)的不同地區(qū)菌株進(jìn)行序列比較，進(jìn)一步表明6株中國分離株與非洲

11、一澳大利亞群菌株相同，選擇性引物的擴(kuò)增結(jié)果也支持這一結(jié)果。根據(jù)以上分析結(jié)果，可以認(rèn)為中國流行的MmmSC在分子特征上與非洲一澳大利亞群完全相同。 通過上述研究在國內(nèi)首次建立了敏感、特異適用于基層應(yīng)用的間接ELISA方法，在內(nèi)蒙古、新疆等省區(qū)應(yīng)用獲得了良好的評價。建立了病原特異性PCR診斷方法，可以在8個小時內(nèi)獲得疑似樣品的診斷結(jié)果，應(yīng)用該方法在新疆進(jìn)行了疑似牛肺臟樣品的檢測，與病原分離以及血清學(xué)檢測結(jié)果相一致。通過對6株來自中國