致病疫霉基因組微衛(wèi)星標記開發(fā)及應用.pdf

1、由致病疫霉（Phytophthora infestans）引起的馬鈴薯晚疫病是馬鈴薯生產上最具毀滅性的病害之一。致病疫霉微衛(wèi)星標記可以作為研究致病疫霉生物遺傳學、群體動態(tài)演替和多樣性的分子標記。2010年致病疫霉基因組被破譯，為研究微衛(wèi)星位點在基因組中的分布規(guī)律以及微衛(wèi)星標記的批量開發(fā)提供了基礎數據。本研究在分析致病疫霉基因組微衛(wèi)星序列的基礎上，研究和開發(fā)致病疫霉微衛(wèi)星分子標記，旨在為致病疫霉群體遺傳結構研究提供參考。主要研究結果如下:

2、
　　 1.利用微衛(wèi)星序列分析軟件SciRoKo3.3確定致病疫霉基因組及其不同區(qū)域完美型和復合型微衛(wèi)星的數量，并分析其分布規(guī)律。分析發(fā)現，在致病疫霉基因組中共有5010個完美型微衛(wèi)星位點，出現頻率平均為26.35個/Mb，最偏好基元類型為ACGG、AT和AAG。外顯子區(qū)域微衛(wèi)星基元長度為3～6 bp的微衛(wèi)星，其中基元長度為3和6bp的微衛(wèi)星占93.68％。復合型微衛(wèi)星位點有275個，其中，82.18％為中斷完美類型。
　

3、　 2.根據微衛(wèi)星序列特點及標記原理，推測理論適合微衛(wèi)星標記開發(fā)的位點應該滿足單拷貝、高多態(tài)性和單一變量3個條件。因此，利用軟件SciRoKo3.3、ClustalX1.81及GenBank中Primer-BLAST引物特異性檢測程序，確定了致病疫霉基因組內共有430個適合開發(fā)高多態(tài)性微衛(wèi)星標記位點。其中，基因區(qū)比基因間區(qū)的完美微衛(wèi)星比例高、單拷貝頻率高，更適合于微衛(wèi)星分子標記的開發(fā)。
　　 3.選取序列長度(L)≥25 bp

4、的適合高多態(tài)性微衛(wèi)星標記開發(fā)的位點，在這些位點的兩端序列上設計專一性PCR擴增引物，選擇9株致病疫霉菌對引物的專一性和微衛(wèi)星的多態(tài)性進行檢測。共獲得了115個適合微衛(wèi)星標記開發(fā)的位點，經可行性驗證確定了64個微衛(wèi)星標記，包含有多態(tài)性的33個，占51.56％，無多態(tài)性的31個。將具多態(tài)性的33個微衛(wèi)星標記利用UPGMA聚類方法進行聚類分析。通過對40株致病疫霉的區(qū)分情況分析，發(fā)現與所有具多態(tài)性標記區(qū)分度相同的最小標記數量為9。
　　

5、 4.利用40株采自不同年份和地區(qū)的致病疫霉菌株對可行性微衛(wèi)星標記進行等位基因數的確定及其多態(tài)性評估。發(fā)現具有多態(tài)性標記的微衛(wèi)星PIC值都在0.164～0.614之間，其中PIC≥0.5的標記有7個，分別為E-04958、I-00408、F5-22735、I-10840、I-06861、I-01408和I-07111;0.25＜PIC＜0.5的標記有25個;PIC≤0.25的有1個。
　　 5.利用已篩選的9個致病疫霉微衛(wèi)星標