不依賴于NF-κB信號通路的細胞因子破壞血管內皮屏障功能.pdf

1、一、研究背景
　　 慢性炎癥的發(fā)生發(fā)展是通過不斷的釋放失去調節(jié)的細胞因子、大量募集炎性細胞以及增加血管通透性造成組織器官的損傷。在這一過程中，血管內皮細胞的粘附和結構屏障功能變化起到了關鍵作用。
　　 研究證實，炎性細胞因子如白介素1β(IL-1β)在體內可以引起循環(huán)中的白細胞遷出并在損傷組織間隙聚集。目前已知該反應中，白介素1β可通過與胞膜上受體結合激活髓細胞樣分化蛋白88(MyD88)介導的核轉錄因子κB(NF-κB

2、)依賴的信號通路，促進白細胞的粘附、變形和遷出。然而對于白介素1β導致血管屏障功能的損傷，增加血管的通透性，其具體是否也依賴于NF-κB通路的激活，目前仍不得而知。
　　 血管內皮在循環(huán)系統和周圍組織間產生結構型屏障，調控血管中血漿成分和血細胞的向周圍組織滲漏。血管的通透性由兩種途徑調節(jié)：一種是經細胞通透途徑；另一種是細胞旁通透途徑。在炎癥反應時，細胞旁通透途徑對于血管內皮通透性的調節(jié)尤為重要。細胞旁通透途徑主要由內皮細胞間連接

3、調控，通過對內皮細胞超微結構的觀察發(fā)現，粘附連接是血管內皮細胞間的主要連接形式。而構成內皮間粘附連接的主要分子是血管內皮鈣黏蛋白(VE-cadherin)。它是血管內皮細胞特異性鈣黏蛋白，其結構和分布對于維持血管內皮細胞的生理功能起著重要的作用。
　　 ADP核基環(huán)化因子6(Arf6)是ras超家族中的一個小分子GTP結合蛋白，屬于ARF亞家族成員，分子量僅20kD左右，在真核生物細胞中廣泛表達并且序列及其保守。目前研究發(fā)現AR

4、F6主要參與調節(jié)細胞質膜運輸和胞內肌動蛋白裝配而涉及到多種生理功能，包括囊泡內吞、分泌、膜出芽、胞質分裂、吞噬、細胞粘連、細胞遷移等。
　　 Arf6的活化受到GTP酶激活蛋白(GAPs)和鳥苷交換因子(GEFs)的共同調節(jié)。Arf-GAPs是負調節(jié)因子，能催化與Arf6結合的GTP水解成GDP而抑制它的活性，而Arf-GEFs是正調節(jié)因子，能促進ARF6-GDP向ARF6-GTP的轉換從而激活Arf6。
　　 在我們之

5、前的研究中發(fā)現Arf6的活化程度與血管內皮的屏障功能有密切聯系：阻斷Arf6激活可以穩(wěn)定血管內皮，激活Arf6可以增加新生血管的發(fā)生以及血管內皮通透性。
　　 探尋炎癥發(fā)生時血管內皮通透性改變的機制，研究炎性細胞因子IL-1β對于血管內皮細胞影響的具體通路，都可以為存在炎癥反應的疾病治療提供解決的靶點提示。
　　 二、研究目的
　　 本課題擬研究白介素-1β通過何種信號轉導途徑影響血管內皮通透性；Arf6與VE-

6、cadherin之間的關系，如何通過調控Arf6來影響VE-cadherin的表達分布，協調內皮細胞間連接穩(wěn)定性；尋找IL-1β、Arf6以及VE-cadherin相互之間是否有聯系；并選取慢性炎癥的動物模型(CIA)驗證體外實驗的結論。
　　 三、材料和方法
　　 購買HMVECs原代并進行培養(yǎng)擴增，第5代細胞用于實驗。GTP-Arf6pulldown實驗檢測全細胞裂解液中Arf6GTP形式的含量。單細胞層的電阻用EC

7、IS系統(AppliedBiophysics)檢測，數據單位為歐姆。利用Transwell系統檢測單細胞層對辣根過氧化物酶的滲透量。細胞免疫熒光染色、細胞膜組分分離以及Western免疫印記等方法檢測HMVECs細胞膜上VE-cadherin的量及分布形態(tài)。
　　 購買帶有Arf6-Q67L基因片段或綠色熒光蛋白的腺病毒載體，按照適當濃度感染HMVECs，感染48小時后進行實驗。購買目的基因的siRNA溶解分裝后，以Hiperf

8、ect轉染試劑進行兩次基因干擾，第二次干擾后48小時用實驗。
　　 利用PCR、酶切、連接、轉化、篩選、測序以及擴繒培養(yǎng)、質粒抽提等方法構建并獲得大量MyD88和ARNO的全長及功能片段載體，以脂質體將目的片段轉染至293T細胞中，轉染48小時后進行免疫共沉淀實驗。
　　 牛Ⅱ型膠原蛋白溶液與完全弗氏佐劑注射DBA/1J小鼠，21天后與不完全弗氏佐劑再次注射得到膠原誘導性關節(jié)炎動物模型。利用關節(jié)炎指數進行評分分組，經過D

9、MSO、SecinH3以及Enbrel(R)處理后，進行組織學檢查。
　　 四、結果
　　 1.IL-1β誘導血管通透性的增高不依賴于NF-κB通路
　　 加入核因子-κB抑制因子激酶(IKK)的抑制劑(SC514)可以阻斷IL-1β誘導的NF-κB由胞漿移入細胞核，但是它不能阻止IL-1β誘導的HMVECs單細胞層跨膜電阻降低，對辣根過氧化物酶的通透性增高以及細胞膜表面VE-cadherin減少。
　　

10、 在內皮細胞培養(yǎng)過程中加入已知IL-1β激活的下游信號通路分子ERK1/2，p38和JNK的抑制劑可以分別阻斷各自的信號通路激活，但是它們都不能阻止IL-1β誘導的HMVECs的單細胞層對辣根過氧化物酶通透增加，跨膜電阻減低以及細胞表面VE-cadherin定位分布的減少。
　　 2.IL-1β破壞血管內皮屏障功能，增加血管通透性，與IL-1β--MyD88-ARNO-Arf6-VE-cadherin的信號通路激活有關
　

11、　 通過Arf6pulldown實驗發(fā)現，在HMVECs中IL-1β可以迅速并持久的使Arf6GTP形式增加；在經過Arf6RNA干涉處理的HMVECs中，Arf6表達降低，進而檢測到在加入IL-1β刺激的HMVECs單細胞層較未處理者對辣根過氧化物酶通透性降低，細胞膜表面定位分布的VE-cadherin增加并且與未加IL-1β刺激者相比無顯著變化。
　　 在感染持續(xù)激活的Arf6基因片段的HMVECs中發(fā)現，激活的Arf6增

12、加促進了單細胞層跨膜電阻的降低以及VE-cadherin在細胞膜的定位分布的減少。
　　 在HMVECs中加入ArfGAP抑制劑QS11，Arf6GTP形式顯著增加，QS11處理的HMVECs單細胞層較DMSO處理者的跨膜電阻的降低，對辣根過氧化物酶通透性增加，細胞膜表面定位分布的VE-cadherin減少并出現排列紊亂。
　　 cytohesins(GEF家族成員)的小分子抑制劑SecinH3處理HMVECs后發(fā)現，細

13、胞膜表面VE-cadherin在細胞膜表面的分布增加，并可以抑制IL-1β刺激引起的Arf6GTP形式增加，同時挽回IL-1β引起的單細胞層跨膜電阻的降低，阻止對辣根過氧化物酶通透性增加，穩(wěn)定細胞膜表面定位分布的VE-cadherin。
　　 經過ARNO(GEF家族成員)RNA干涉的HMVECs，加入IL-1β不僅不能再引起Arf6GTP增加，而且阻止了處理組單細胞層在IL-1β刺激下對辣根過氧化物酶通透性改變以及細胞膜表面V

14、E-cadherin分布。
　　 利用siRNA干擾技術分別將白介素1受體已知下游通路的分子依次knockdown，發(fā)現siRNA干擾MyD88的表達可以抑制IL-1β誘導的Arf6GTP增加并阻斷其誘導的對辣根過氧化物酶通透性增加，但是siRNA干擾IRAK表達不能做到這些。
　　 利用免疫共沉淀的方法，研究MyD88、ARNO全長之間；MyD88各功能片段與ARNO全長之間；ARNO各功能片段與MyD88全長之間的關

15、系。結果發(fā)現，MyD88和ARNO之間有直接的相互連接。
　　 3.抑制Arf-GEFs可以降低CIA誘導的血管通透性和關節(jié)炎的嚴重性，MyD88-ARNO-Arf6通路可以作為類風濕性關節(jié)炎治療的有效靶點在標準的慢性炎性關節(jié)炎動物模型即膠原誘導性關節(jié)炎(CLA)中給予阻斷IL-1β-MyD88-ARNO-Arf6通路的Arf-GEFs的抑制劑SecinH3進行治療。結果發(fā)現，SecinH3可以明顯抑制被CIA誘導的血管通透性增

16、加，關節(jié)炎的發(fā)展明顯減輕，表現為炎癥反應、血管翳生成、軟骨損傷和骨損傷都明顯減少。
　　 五、結論
　　 1.IL-1β誘導血管通透性的增高是不依賴于NF-κB通路的。
　　 2.IL-1β破壞血管內皮屏障，增加血管通透性與IL-1β-MyD88-ARNO-Atf6-VE-cadherin的信號通路激活緊密相關。GAPs和GEFs可以通過調控Arf6的活化，影響血管內皮通透性，其中ARNO是HMVECs中激活Ar