NF-κB信號通路對高糖誘導的人臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖和凋亡的影響.pdf

1、目的： 構(gòu)建針對NF-κB p65基因的RNAi腺病毒表達載體，從轉(zhuǎn)錄后水平抑制p65基因表達，為研究NF-κB信號通路提供技術工具；研究高糖尤其是波動性高糖對人臍靜脈內(nèi)皮細胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cell，HUVEC)增殖和凋亡的作用；利用構(gòu)建的RNAi腺病毒感染HUVEC，抑制p65表達，觀察NF-κB信號通路對高糖誘導的血管內(nèi)皮細胞增殖和凋亡的影響。 方法： 設

2、計合成針對NF-κBp65 mRNA序列1566位點的shRNA編碼序列，克隆到腺病毒穿梭質(zhì)粒中，然后通過體外同源重組構(gòu)建重組RNAi腺病毒表達載體；在HEK293A細胞中包裝并擴增病毒，空斑實驗法測定病毒滴度；腺病毒感染HUVEC，Western Blot法檢測構(gòu)建的RNAi腺病毒對p65表達的抑制效果；并利用RNAi腺病毒抑制p65表達，探討NF-κB信號通路對高糖誘導的HUVEC增殖和凋亡的影響。 結(jié)果： 1.成功

3、構(gòu)建了針對NF-κBp65特異的RNAi腺病毒表達載體； 2.NF-κBp65特異的RNAi腺病毒感染HUVEC后可使p65表達量明顯下降，RNAi腺病毒MOI值25～50即可以實現(xiàn)對HUVEC p65表達的有效抑制； 3.RNAi腺病毒感染HUVEC后48h開始檢測到p65表達量下降，且隨時間延長p65表達量進一步減少，抑制效應至少持續(xù)至感染后第六天； 4.高糖(20.5mmol/L或30.5mmol/L)，尤

4、其是波動性高糖可以抑制HUVEC增殖，并且促進HUVEC凋亡； 5.NF-κBp65特異腺病毒感染HUVEC，可以明顯抑制高糖刺激的NF-κBp65核蛋白轉(zhuǎn)錄，使核內(nèi)p65蛋白表達處于基礎水平； 6.BrdU結(jié)果分析，NF-κBp65特異腺病毒感染HUVEC可以使高糖誘導的細胞增殖抑制明顯下降(P＜0.01)，與正常葡萄糖濃度(5.5 mmol/L)下的細胞增殖率相當(P＞0.05)；脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導的缺口末

5、端標記法(terminal-deoxynucleotidyltransferase mediated nick end labeling，TUNEL)及流式細胞檢測結(jié)果均提示NF-κBp65特異腺病毒可以保護高糖誘導的HUVEC凋亡；流式細胞檢測NF-κBp65特異腺病毒可以使高糖下內(nèi)皮細胞凋亡率降到正常糖濃度水平(P＞0.05)，但TUNEL結(jié)果顯示無法降至正常糖濃度下的細胞凋亡率(P＜0.01)。 結(jié)論： 構(gòu)建NF-