tBHQ拮抗無機(jī)砷所致人皮膚角質(zhì)細(xì)胞損傷及其可能機(jī)制.pdf

1、前言
　　 長期慢性高砷暴露可發(fā)展為機(jī)體多器官腫瘤。皮膚是砷中毒的主要靶器官之一,患者臨床主要表現(xiàn)為掌跖皮膚過度角化、和皮膚色素異常沉著或脫失,病情嚴(yán)重者可見砷性Bowen's病或皮膚癌。研究砷對(duì)皮膚的損害作用及其可能機(jī)制,并尋找針對(duì)慢性砷中毒皮膚損害的有效控制和治療手段、降低砷所致皮膚癌的發(fā)病危險(xiǎn)等具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。
　　 大量研究已證實(shí),無機(jī)砷暴露能夠?qū)е录?xì)胞損傷。亞砷酸鈉(NaAsO2)可使人類角質(zhì)細(xì)胞活力

2、明顯下降,高濃度的As2O3還可抑制正常人類角質(zhì)細(xì)胞(NHK)和人類角質(zhì)化細(xì)胞(HaCaT)的生長。砷還可使細(xì)胞周期異常改變,甚至發(fā)生細(xì)胞凋亡,以及一些周期相關(guān)蛋白的改變。大量研究還證實(shí),氧化應(yīng)激是砷致細(xì)胞毒性作用的重要機(jī)制之一。NaAsO2可引起細(xì)胞氧化損傷。同時(shí)人們也發(fā)現(xiàn),細(xì)胞內(nèi)ROS的水平對(duì)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)具有重要影響。
　　 另一方面,核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2通路的活化是近年來發(fā)現(xiàn)的機(jī)體應(yīng)對(duì)化學(xué)物和毒物毒性的一種主要的防御反應(yīng)。N

3、rf2轉(zhuǎn)位入核與抗氧化反應(yīng)元件(ARE)結(jié)合,調(diào)控Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄,可維持細(xì)胞氧化還原狀態(tài)平衡和降低氧化損傷。研究還發(fā)現(xiàn),叔丁基對(duì)苯二酚(tBHQ)是Nrf2轉(zhuǎn)位入核的強(qiáng)烈誘導(dǎo)劑,具有極強(qiáng)的細(xì)胞保護(hù)作用。有關(guān)tBHQ拮抗砷毒性作用的研究發(fā)現(xiàn),tBHQ能夠阻斷砷誘導(dǎo)的一些細(xì)胞毒性等損傷。但是目前,tBHQ對(duì)砷誘導(dǎo)的角質(zhì)細(xì)胞損傷的可能影響尚未見報(bào)道。
　　 據(jù)此,本研究擬選用人永生化表皮細(xì)胞HaCaT細(xì)胞系,觀察tBH

4、Q對(duì)無機(jī)砷致人皮膚角質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞毒性、細(xì)胞周期和相關(guān)調(diào)控蛋白改變的拮抗作用、tBHQ對(duì)無機(jī)砷致角質(zhì)細(xì)胞氧化損傷的拮抗作用以及對(duì)細(xì)胞內(nèi)Nrf2信號(hào)通路的誘導(dǎo)作用。為尋找針對(duì)慢性砷中毒皮膚損害的有效控制和治療手段、減輕砷中毒患者的痛苦和提高生命質(zhì)量、以及降低砷所致皮膚癌的發(fā)病危險(xiǎn)性等提供理論依據(jù)和新的線索。
　　 研究方法
　　 1.AlamarBlue還原法測(cè)定HaCaT細(xì)胞增殖活力
　　 2.倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)

5、改變
　　 3.熒光探針2',7'-二乙酰二氯熒光素檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平
　　 4.流式細(xì)胞儀法測(cè)定細(xì)胞周期
　　 5.硫代巴比妥酸檢測(cè)法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)MDA含量
　　 6.改進(jìn)的黃嘌呤氧化酶檢測(cè)法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)SOD活性
　　 7.鉬酸銨檢測(cè)法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)CAT活性
　　 8.Westernblot法分析細(xì)胞內(nèi)Nrf2、NQO1、HO-1、CyclinD1和CDK4的蛋白表達(dá)水平
　　 9

6、.實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)NQO1和HO-1的mRNA表達(dá)水平
　　 結(jié)果
　　 1.tBHQ對(duì)NaAsO2致HaCaT細(xì)胞增殖活力下降、細(xì)胞周期阻滯及其調(diào)控蛋白異常改變的拮抗作用
　　 NaAsO2單獨(dú)作用HaCaT細(xì)胞,AlarnarBlue還原率隨染砷濃度的增加而明顯下降,差異具有顯著性(p＜0.01)。而tBHQ預(yù)處理后,細(xì)胞AlamarBlue還原率與相同濃度NaAsO2單獨(dú)作用組相比明顯恢復(fù),且差異

7、具有統(tǒng)計(jì)性(p＜0.01)。
　　 NaAsO2單獨(dú)作用HaCaT細(xì)胞,G0/G1期細(xì)胞比例明顯下降(p＜0.01),S期和G2/M期細(xì)胞比例較對(duì)照組明顯增加(p＜0.01)。tBHQ預(yù)處理后,tBHQ(50μmol/L)預(yù)處理的NaAsO2(25、50μmol/L)組細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例有所上升(p＜0.01);tBHQ(50μmol/L)預(yù)處理的NaAsO2(50μmol/L)組S期細(xì)胞比例明顯下降(p＜0.01);G2

8、/M期細(xì)胞比例整體呈下降趨勢(shì)。
　　 NaAsO2單獨(dú)作用于HaCaT細(xì)胞,細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CyclinD1和CDK4的蛋白表達(dá)隨NaAsO2染毒濃度的增加而明顯下降(p＜0.01)。tBHQ預(yù)處理后,CyclinD1和CDK4蛋白表達(dá)均明顯高于相同濃度NaAsO2單獨(dú)作用組(p＜0.01)。
　　 2.tBHQ對(duì)NaAsO2致HaCaT細(xì)胞氧化損傷的拮抗作用
　　 NaAsO2單獨(dú)作用HaCaT細(xì)胞,細(xì)胞內(nèi)RO

9、S水平和MDA含量明顯升高,同時(shí)SOD和CAT酶活性明顯下降(p＜0.01)。tBHQ預(yù)處理后,細(xì)胞內(nèi)ROS水平和MDA含量下降,而SOD和CAT酶活性明顯恢復(fù)(p＜0.01)。
　　 3.tBHQ對(duì)NaAsO2致HaCaT細(xì)胞內(nèi)Nrf2蛋白、及Nrf2下游調(diào)控基因NQO1和HO-1蛋白和mRNA表達(dá)的影響
　　 tBHQ單獨(dú)作用可長時(shí)間持續(xù)誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞內(nèi)Nrf2、NQO1和HO-1的蛋白表達(dá),且均明顯高于對(duì)照組(

10、p＜0.01)。
　　 tBHQ預(yù)處理再與NaAsO2共同處理,Nrf2、NQO1和HO-1的蛋白表達(dá)均明顯高于相同濃度NaAsO2單獨(dú)作用組(p＜0.01)。NQO1和HO-1的mRNA表達(dá)水平也明顯高于相同濃度NaAsO2單獨(dú)作用組(p＜0.01)。
　　 結(jié)論
　　 1.tBHQ對(duì)無機(jī)砷致人皮膚角質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞毒性和細(xì)胞周期異常變化等具有一定的拮抗作用。
　　 2.tBHQ能夠減輕無機(jī)砷致人皮膚角質(zhì)細(xì)