米諾環(huán)素通過(guò)5-脂氧酶對(duì)局灶性腦缺血后炎癥及修復(fù)過(guò)程的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究表明，腦缺血后繼發(fā)的急慢性炎癥加劇腦損傷。5-脂氧酶(5-lipoxygenase，5-LOX)是催化花生四烯酸生成炎癥介質(zhì)白三烯(leukotrienes，LTs)的關(guān)鍵酶。白三烯包括白三烯B4(leukotriene B4，LTB4)和半胱氨酰白三烯(cysteinylleukotrienes，CysLTs，包括LTC4、LTD4和LTE4)，是體內(nèi)一類重要的炎癥介質(zhì)，介導(dǎo)白細(xì)胞趨化、平滑肌痙攣、微血管滲漏等反應(yīng)，

2、參與多種炎癥性疾病的病理過(guò)程。 早期有關(guān)5-LOX的研究主要集中在哮喘、過(guò)敏性鼻炎等外周疾病。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，5-LOX和半胱氨酰白三烯受體1(cysteinyl leukotriene receptor 1，CysLT1)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)，增加血腦屏障通透性和促進(jìn)腦水腫形成，參與腦缺血、腦外傷、腦腫瘤等疾病的病理生理過(guò)程。腦缺血急性和亞急性期，腦內(nèi)5-LOX表達(dá)及其代謝產(chǎn)物白二烯含量顯著增加。5-LOX抑制劑[如AA861、

3、MK-886、去甲二氫愈創(chuàng)木酸(nordihydroguaiaretic acid，NDGA)、咖啡酸(caffeic acid，CA)]以及CysLT1受體拮抗劑(如普魯司特、孟魯司特等)對(duì)腦缺血損傷有保護(hù)作用。 腦缺血后期的主要特征之一是梗死周邊區(qū)反應(yīng)性膠質(zhì)增生(主要由星形膠質(zhì)細(xì)胞組成)和膠質(zhì)疤痕形成，形成軸突再生的物理／生化屏障。最近我們實(shí)驗(yàn)室的研究發(fā)現(xiàn)，大鼠局灶性腦缺血損傷后期，5-LOX和CysLT1受體表達(dá)增加，主要

4、定位在梗死周邊區(qū)的星形膠質(zhì)細(xì)胞上，介導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖和膠質(zhì)疤痕的形成。5-LOX抑制劑咖啡酸和CysLT1受體拮抗劑普魯司特能抑制梗死周邊區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖，對(duì)腦缺血慢性損傷有保護(hù)作用。另外，近來(lái)有文獻(xiàn)報(bào)道編碼5-LOX激活蛋白(5-lipoxygenase-activating protein，F(xiàn)LAP)基因可增加腦卒中的風(fēng)險(xiǎn)。上述研究表明5-LOX參與腦缺血損傷的早期炎癥和后期修復(fù)過(guò)程，可能是治療腦缺血損傷的一個(gè)潛在較好靶點(diǎn)。但是

5、，5-LOX如何參與腦缺血后炎癥過(guò)程，是否由CysLT1受體介導(dǎo)?目前尚不清楚。另一方面，米諾環(huán)素是半合成的第二代四環(huán)素類抗生素。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，米諾環(huán)素有不依賴抗菌作用的抗炎效應(yīng)。1998年首次報(bào)道米諾環(huán)素對(duì)全腦缺血的保護(hù)作用后，大量研究表明米諾環(huán)素對(duì)多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病有保護(hù)作用，如腦卒中、多發(fā)性硬化、脊髓損傷、帕金森病、亨廷頓病和脊髓側(cè)索硬化等。米諾環(huán)素的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制與抗炎和抗凋亡等有關(guān)。如米諾環(huán)素能抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活和增殖、誘生型一氧化

6、氮合酶(iNOS)，白介素1β轉(zhuǎn)化酶(ICE)和環(huán)氧酶-2(COX-2)的表達(dá)、以及gaspase依賴和非依賴的細(xì)胞凋亡通路。最近，我們離體實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，米諾環(huán)素對(duì)培養(yǎng)的PCI2細(xì)胞缺血樣損傷和NMDA誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性具有保護(hù)作用，同時(shí)能抑制5-LOX轉(zhuǎn)位到核膜(5-LOX激活)。提示米諾環(huán)素對(duì)PCI2細(xì)胞缺血樣損傷和NMDA誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性有保護(hù)作用，部分是通過(guò)抑制5-LOX激活實(shí)現(xiàn)。在整體腦缺血模型中，米諾環(huán)素是否通過(guò)抑制5-LOX表達(dá)

7、和激活發(fā)揮抗腦缺血損傷作用尚不清楚。 綜上所述，目前在整體水平尚有以下問(wèn)題未闡明：(1)5-LOX參與腦缺血后炎癥的特點(diǎn)是什么?(2)5-LOX是否通過(guò)CysLT1受體介導(dǎo)腦缺血后炎癥反應(yīng)?(3)米諾環(huán)素是否通過(guò)抑制5-LOX激活減輕炎癥、改善修復(fù)過(guò)程及促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。因此，本研究擬在大鼠局灶性腦缺血／再灌注損傷模型闡明上述問(wèn)題。 第一部分5-脂氧酶／半胱氨酰白三烯受體1通路介導(dǎo)大鼠腦缺血后炎癥反應(yīng) 目的：觀察

8、5-LOX參與腦缺血損傷后炎癥的特點(diǎn)及其是否通過(guò)CysLT1受體介導(dǎo)。方法：線栓法誘導(dǎo)大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞模型，缺血30 min再灌72 h，觀察5-LOX抑制劑NDGA(10 mg／Kg)和CysLT1拮抗劑普魯司特(0.1 mg／kg)對(duì)腦缺血損傷的保護(hù)作用；應(yīng)用免疫組化方法觀察腦缺血后IgG滲出、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞／小膠質(zhì)細(xì)胞浸潤(rùn)、ICAM-1和P-選擇素表達(dá)情況；同時(shí)應(yīng)用酶聯(lián)免疫方法檢測(cè)半胱氨酰白三烯(CysLTs)和白三烯B4

9、(LTB4)含量。結(jié)果：NDGA和普魯司特能改善腦缺血后的神經(jīng)功能，減少梗死體積，減少IgG滲出，抑制中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，減少粘附分子ICAM-1表達(dá)；NDGA還能顯著抑制P-選擇素表達(dá)，減少CysLTs和LTB4含量：但兩者都不能抑制巨噬細(xì)胞／小膠質(zhì)細(xì)胞浸潤(rùn)。結(jié)論：局灶性腦缺血后炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，血腦屏障通透性和粘附分子表達(dá)增加，同時(shí)5-LOX產(chǎn)物含量增加；5-LOX抑制劑和CysLT1受體拮抗劑部分抑制炎癥反應(yīng)。結(jié)果表明5-LOX部分通過(guò)C

10、ysLT1受體參與炎癥反應(yīng)。 第二部分米諾環(huán)素抑制大鼠局灶性腦缺血損傷后5-LOX激活和炎癥反應(yīng) 目的：觀察米諾環(huán)素對(duì)大鼠局灶性腦缺血的抗炎作用是否是通過(guò)抑制5-LOX表達(dá)和激活實(shí)現(xiàn)。方法：MCAO 30 min后再灌注72 h，米諾環(huán)素(22.5，45 mg／kg)連續(xù)給藥3天，觀察缺血損傷情況、內(nèi)源性IgG滲出、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞／小膠質(zhì)細(xì)胞浸潤(rùn)；同時(shí)采用免疫組化和RT-PCR檢測(cè)5-LOX蛋白和mRNA表達(dá)情況，

11、免疫熒光雙標(biāo)法觀察5-LOX的細(xì)胞定位，再灌后3 h用酶聯(lián)免疫方法檢測(cè)白三烯含量。結(jié)果：米諾環(huán)素能改善腦損傷，減少IgG滲出、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞／小膠質(zhì)細(xì)胞的聚集；5-LOX在缺血中心區(qū)主要表達(dá)在神經(jīng)元上，而在缺血周邊區(qū)可表達(dá)在星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞上；米諾環(huán)素能顯著抑制5-LOX蛋白、mRNA表達(dá)和白三烯產(chǎn)物。結(jié)論：米諾環(huán)素抑制腦缺血后炎癥的作用部分通過(guò)抑制5-LOX表達(dá)和激活。 第三部分米諾環(huán)素抑制大鼠腦缺血慢性期5-L

12、OX表達(dá)和促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù) 目的：觀察米諾環(huán)素對(duì)腦缺血慢性期的保護(hù)作用及其與5-LOX表達(dá)之間的關(guān)系。方法：MCAO 60 min后再灌注36 d，米諾環(huán)素(45 mg/kg)連續(xù)給藥6 d，在腦缺血后1～28 d分別采用肢體放置實(shí)驗(yàn)、錯(cuò)步實(shí)驗(yàn)、粘膠揭除實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)大鼠感覺運(yùn)動(dòng)功能，腦缺血后30~35 d用八臂迷宮評(píng)價(jià)大鼠認(rèn)知功能：組織學(xué)評(píng)價(jià)梗死體積和神經(jīng)元存活；用免疫組化方法觀察腦缺血后36 d膠質(zhì)細(xì)胞增殖和5-LOX表達(dá)情況。結(jié)