TRAF2 siRNA對增加口腔鱗癌放療敏感性作用的研究.pdf

1、目的:
　　口腔鱗癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一。對于口腔鱗癌的治療，目前主要以外科手術(shù)為主，協(xié)同放化療或生物治療的綜合治療。雖綜合治療已取得了一定效果，但對于中晚期口腔鱗癌患者，療效仍不理想，總體生存率并無顯著提高。相對于放、化療等傳統(tǒng)的腫瘤治療手段，靶向治療具有特異性強(qiáng)、用藥量低、毒副作用小、人體耐受性好等優(yōu)點(diǎn)。近年來，已有多種靶向治療應(yīng)用于臨床，并取得良好

2、效果。但由于腫瘤細(xì)胞生長受多種途徑調(diào)控的特性，針對單一途徑的靶向治療長期預(yù)后受限，腫瘤易復(fù)發(fā)，因此，發(fā)現(xiàn)新的靶向于腫瘤組織或者細(xì)胞的分子，尤其是參與多條信號通路的關(guān)鍵分子，在腫瘤治療和早期診斷上有非常重要的臨床意義。腫瘤壞死受體相關(guān)因子2(Tumornecrosis factor receptor-associated factor2，TRAF2)是一類重要的胞漿銜接蛋白，它在多種惡性腫瘤細(xì)胞存在著高表達(dá)，也是該家族中唯一的介導(dǎo)多條凋亡

3、保護(hù)信號通路中的蛋白，是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)、外途徑凋亡的關(guān)鍵因子，但它在口腔頜面部惡性腫瘤，尤其口腔鱗癌中的特異性表達(dá)及其生物學(xué)功能尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本文第一部分研究TRAF2在口腔惡性腫瘤特別是鱗癌中的表達(dá)及其與患者臨床病理指標(biāo)間相關(guān)性的研究，第二部份探討了TRAF2 siRNA轉(zhuǎn)染（TRAF2基因沉默）對舌鱗癌細(xì)胞系CAL27生物學(xué)行為的影響，第三部分和第四部分研究了TRAF2 siRNA轉(zhuǎn)染結(jié)合放射治療對體外培養(yǎng)的CAL27細(xì)胞及口腔鱗癌動

4、物模型體內(nèi)腫瘤的生物學(xué)行為的影響。本研究以口腔鱗癌臨床標(biāo)本、細(xì)胞系培養(yǎng)、動物模型等一系列實(shí)驗(yàn)對象，系統(tǒng)地進(jìn)行了體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)研究，擬確定TRAF2為口腔鱗癌靶向治療的關(guān)鍵位點(diǎn)，確定TRAF2基因沉默（TRAF2 siRNA）可促進(jìn)放療增敏作用，從而為口腔鱗癌臨床治療提供一種新治療思路及其實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　1.通過免疫組織化學(xué)的方法檢測57例口腔惡性腫瘤組織標(biāo)本（50例鱗癌組織和7例其它惡性腫瘤）和30例癌旁2cm以上

5、正常粘膜組織中TRAF2的表達(dá)，采用免疫組織化學(xué)得分和平均光密度值來確定TRAF2在組織中的反應(yīng)強(qiáng)度，統(tǒng)計(jì)分析TRAF2表達(dá)與腫瘤大小、TNM臨床分期、病理分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性。
　　2.將TRAF2 siRNA轉(zhuǎn)染舌鱗癌細(xì)胞系CAL27，Western Blot法鑒定siRNA轉(zhuǎn)染后的TRAF2蛋白表達(dá)下調(diào)（基因沉默）效果以及NF-κB信號通路中TRAF2下游蛋白RIP1表達(dá)的改變。通過CCK8細(xì)胞活力檢測技術(shù)

6、、流式細(xì)胞術(shù)（AnnexinⅤ/PI雙染法）等方法檢測TRAF2 siRNA轉(zhuǎn)染對口腔鱗癌細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期分布等生物學(xué)行為的影響。
　　3.采用不同劑量(2Gy，4Gy，6Gy，8Gy)的X射線照射TRAF2 siRNA轉(zhuǎn)染、Control siRNA轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染的舌鱗癌細(xì)胞系CAL27，通過CCK8細(xì)胞活力檢測技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)（AnnexinⅤ/PI雙染法，PI單染法）等方法驗(yàn)證TRAF2 siRNA對細(xì)胞放療增敏的效果

7、，檢測不同放射劑量對TRAF2 siRNA轉(zhuǎn)染的CAL27細(xì)胞增殖、凋亡、周期等生物學(xué)行為的影響，并篩選出適宜的放射劑量用于更深入的動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。
　　4.采用懸液注射法建立CAL27舌癌裸鼠動物模型，通過EntransterTM-in vivo體內(nèi)轉(zhuǎn)染試劑將TRAF2 siRNA直接轉(zhuǎn)染已建模的實(shí)體腫瘤，比較在6Gy放射劑量下TRAF2 siRNA轉(zhuǎn)染組、未轉(zhuǎn)染組和未經(jīng)放射組三組裸鼠腫瘤體積和瘤重的變化。
　　結(jié)果:

8、>　　1.在50例口腔鱗癌組織中，TRAF2表達(dá)陽性46例，其陽性表達(dá)率為92％，其中26例表達(dá)弱陽性（占52％），20例表達(dá)陽性（占40％）。TRAF2在口腔其他惡性腫瘤中表達(dá)呈100％陽性，但在正?？谇徽衬そM織中低表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明TRAF2的表達(dá)程度與口腔癌的病理分級、淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)(P＜0.05)，但尚不能證明TRAF2與腫瘤大小、TNM臨床分期的生物學(xué)行為有關(guān)(P＞0.05)。
　　2.TRAF2 siRNA可有效轉(zhuǎn)染舌

9、鱗癌細(xì)胞系CAL27，轉(zhuǎn)染后TRAF2蛋白表達(dá)明顯下降，并出現(xiàn)NF-κB途徑中相應(yīng)下游蛋白RIP的表達(dá)下降。通過對TRAF2 siRNA轉(zhuǎn)染組、對照轉(zhuǎn)染組和空白組細(xì)胞活力和早期凋亡率的進(jìn)一步對比中發(fā)現(xiàn)，TRAF2siRNA轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖活性沒有明顯改變，但細(xì)胞早期凋亡率有一定增高(P＜0.05)。
　　3.比較不同放射劑量下TRAF2 siRNA轉(zhuǎn)染組、對照轉(zhuǎn)染組和空白組細(xì)胞的細(xì)胞活力、早期凋亡率和細(xì)胞周期分布，發(fā)現(xiàn)在放射下，三組

10、細(xì)胞均出現(xiàn)了細(xì)胞活力和早期凋亡率的改變以及G2/M期阻滯作用，其中TRAF2 siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞改變最為明顯。當(dāng)放射劑量在6Gy時(shí)，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞活力下降和早期凋亡率升高以及G2/M期細(xì)胞比例增高最為最明顯，組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　4.成功建立CAL27舌癌裸鼠動物模型，比較未放射組、放射組、轉(zhuǎn)染TRAF2siRNA+放射組三組裸鼠腫瘤體積和腫瘤重量，結(jié)果顯示，放射組比未放射組裸鼠腫瘤體積和重量明顯減小，而TRAF2

11、 siRNA轉(zhuǎn)染+放射組裸鼠腫瘤體積和重量減小更加明顯，腫瘤抑制率達(dá)到88.2％，較放射組提高了18.1％。
　　結(jié)論:
　　1.TRAF2在口腔鱗癌組織中呈特異性的高表達(dá)，而在口腔正常組織低表達(dá)。
　　2.TRAF2 siRNA轉(zhuǎn)染可使CAL27舌鱗癌細(xì)胞TRAF2蛋白表達(dá)有效沉默（較congtrol組下降47％）。轉(zhuǎn)染后的腫瘤細(xì)胞增殖能力沒有明顯改變，但腫瘤細(xì)胞的凋亡率隨TRAF2的表達(dá)下降而升高。
　　3.