TRAF2 siRNA對增加口腔鱗癌放療敏感性作用的研究.pdf

1、目的:
　　口腔鱗癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一。對于口腔鱗癌的治療，目前主要以外科手術(shù)為主，協(xié)同放化療或生物治療的綜合治療。雖綜合治療已取得了一定效果，但對于中晚期口腔鱗癌患者，療效仍不理想，總體生存率并無顯著提高。相對于放、化療等傳統(tǒng)的腫瘤治療手段，靶向治療具有特異性強、用藥量低、毒副作用小、人體耐受性好等優(yōu)點。近年來，已有多種靶向治療應用于臨床，并取得良好

2、效果。但由于腫瘤細胞生長受多種途徑調(diào)控的特性，針對單一途徑的靶向治療長期預后受限，腫瘤易復發(fā)，因此，發(fā)現(xiàn)新的靶向于腫瘤組織或者細胞的分子，尤其是參與多條信號通路的關(guān)鍵分子，在腫瘤治療和早期診斷上有非常重要的臨床意義。腫瘤壞死受體相關(guān)因子2(Tumornecrosis factor receptor-associated factor2，TRAF2)是一類重要的胞漿銜接蛋白，它在多種惡性腫瘤細胞存在著高表達，也是該家族中唯一的介導多條凋亡

3、保護信號通路中的蛋白，是調(diào)節(jié)細胞內(nèi)、外途徑凋亡的關(guān)鍵因子，但它在口腔頜面部惡性腫瘤，尤其口腔鱗癌中的特異性表達及其生物學功能尚未見文獻報道。本文第一部分研究TRAF2在口腔惡性腫瘤特別是鱗癌中的表達及其與患者臨床病理指標間相關(guān)性的研究，第二部份探討了TRAF2 siRNA轉(zhuǎn)染（TRAF2基因沉默）對舌鱗癌細胞系CAL27生物學行為的影響，第三部分和第四部分研究了TRAF2 siRNA轉(zhuǎn)染結(jié)合放射治療對體外培養(yǎng)的CAL27細胞及口腔鱗癌動

4、物模型體內(nèi)腫瘤的生物學行為的影響。本研究以口腔鱗癌臨床標本、細胞系培養(yǎng)、動物模型等一系列實驗對象，系統(tǒng)地進行了體內(nèi)、外實驗研究，擬確定TRAF2為口腔鱗癌靶向治療的關(guān)鍵位點，確定TRAF2基因沉默（TRAF2 siRNA）可促進放療增敏作用，從而為口腔鱗癌臨床治療提供一種新治療思路及其實驗依據(jù)。
　　方法:
　　1.通過免疫組織化學的方法檢測57例口腔惡性腫瘤組織標本（50例鱗癌組織和7例其它惡性腫瘤）和30例癌旁2cm以上

5、正常粘膜組織中TRAF2的表達，采用免疫組織化學得分和平均光密度值來確定TRAF2在組織中的反應強度，統(tǒng)計分析TRAF2表達與腫瘤大小、TNM臨床分期、病理分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理指標的相關(guān)性。
　　2.將TRAF2 siRNA轉(zhuǎn)染舌鱗癌細胞系CAL27，Western Blot法鑒定siRNA轉(zhuǎn)染后的TRAF2蛋白表達下調(diào)（基因沉默）效果以及NF-κB信號通路中TRAF2下游蛋白RIP1表達的改變。通過CCK8細胞活力檢測技術(shù)

6、、流式細胞術(shù)（AnnexinⅤ/PI雙染法）等方法檢測TRAF2 siRNA轉(zhuǎn)染對口腔鱗癌細胞增殖、凋亡、細胞周期分布等生物學行為的影響。
　　3.采用不同劑量(2Gy，4Gy，6Gy，8Gy)的X射線照射TRAF2 siRNA轉(zhuǎn)染、Control siRNA轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染的舌鱗癌細胞系CAL27，通過CCK8細胞活力檢測技術(shù)、流式細胞術(shù)（AnnexinⅤ/PI雙染法，PI單染法）等方法驗證TRAF2 siRNA對細胞放療增敏的效果

7、，檢測不同放射劑量對TRAF2 siRNA轉(zhuǎn)染的CAL27細胞增殖、凋亡、周期等生物學行為的影響，并篩選出適宜的放射劑量用于更深入的動物體內(nèi)實驗。
　　4.采用懸液注射法建立CAL27舌癌裸鼠動物模型，通過EntransterTM-in vivo體內(nèi)轉(zhuǎn)染試劑將TRAF2 siRNA直接轉(zhuǎn)染已建模的實體腫瘤，比較在6Gy放射劑量下TRAF2 siRNA轉(zhuǎn)染組、未轉(zhuǎn)染組和未經(jīng)放射組三組裸鼠腫瘤體積和瘤重的變化。
　　結(jié)果:

8、>　　1.在50例口腔鱗癌組織中，TRAF2表達陽性46例，其陽性表達率為92％，其中26例表達弱陽性（占52％），20例表達陽性（占40％）。TRAF2在口腔其他惡性腫瘤中表達呈100％陽性，但在正?？谇徽衬そM織中低表達。本實驗數(shù)據(jù)表明TRAF2的表達程度與口腔癌的病理分級、淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)(P＜0.05)，但尚不能證明TRAF2與腫瘤大小、TNM臨床分期的生物學行為有關(guān)(P＞0.05)。
　　2.TRAF2 siRNA可有效轉(zhuǎn)染舌

9、鱗癌細胞系CAL27，轉(zhuǎn)染后TRAF2蛋白表達明顯下降，并出現(xiàn)NF-κB途徑中相應下游蛋白RIP的表達下降。通過對TRAF2 siRNA轉(zhuǎn)染組、對照轉(zhuǎn)染組和空白組細胞活力和早期凋亡率的進一步對比中發(fā)現(xiàn)，TRAF2siRNA轉(zhuǎn)染后細胞增殖活性沒有明顯改變，但細胞早期凋亡率有一定增高(P＜0.05)。
　　3.比較不同放射劑量下TRAF2 siRNA轉(zhuǎn)染組、對照轉(zhuǎn)染組和空白組細胞的細胞活力、早期凋亡率和細胞周期分布，發(fā)現(xiàn)在放射下，三組

10、細胞均出現(xiàn)了細胞活力和早期凋亡率的改變以及G2/M期阻滯作用，其中TRAF2 siRNA轉(zhuǎn)染組細胞改變最為明顯。當放射劑量在6Gy時，轉(zhuǎn)染組細胞活力下降和早期凋亡率升高以及G2/M期細胞比例增高最為最明顯，組間有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。
　　4.成功建立CAL27舌癌裸鼠動物模型，比較未放射組、放射組、轉(zhuǎn)染TRAF2siRNA+放射組三組裸鼠腫瘤體積和腫瘤重量，結(jié)果顯示，放射組比未放射組裸鼠腫瘤體積和重量明顯減小，而TRAF2

11、 siRNA轉(zhuǎn)染+放射組裸鼠腫瘤體積和重量減小更加明顯，腫瘤抑制率達到88.2％，較放射組提高了18.1％。
　　結(jié)論:
　　1.TRAF2在口腔鱗癌組織中呈特異性的高表達，而在口腔正常組織低表達。
　　2.TRAF2 siRNA轉(zhuǎn)染可使CAL27舌鱗癌細胞TRAF2蛋白表達有效沉默（較congtrol組下降47％）。轉(zhuǎn)染后的腫瘤細胞增殖能力沒有明顯改變，但腫瘤細胞的凋亡率隨TRAF2的表達下降而升高。
　　3.