siRNA干擾Nrf2對喉鱗狀細(xì)胞癌化療敏感性的影響.pdf

1、目的：
　　1.探討小分子干擾RNA（siRNA）技術(shù)抑制核因子NF—E2相關(guān)因子-2（nuclear factor-E2-related factor,Nrf2）的表達(dá)對人喉癌Hep2細(xì)胞化療敏感性及凋亡的影響
　　2.探討SUMO特異性蛋白酶3（SUMO-specific protease3，SENP3）對Nrf2信號通路表達(dá)的影響
　　研究方法：
　　1.運(yùn)用siRNA干擾技術(shù)，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法抑制喉癌細(xì)胞

2、系Hep2中Nrf2表達(dá)，蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢驗(yàn)其轉(zhuǎn)染效果。
　　2.應(yīng)用CCK-8比色技術(shù)行細(xì)胞增殖-毒性實(shí)驗(yàn)，設(shè)立實(shí)驗(yàn)組（Hep2/Nrf2-siRNA，轉(zhuǎn)染Nrf2質(zhì)粒）和對照組(Hep2/control-siRNA，空質(zhì)粒組)，未行轉(zhuǎn)染處理的Hep2細(xì)胞作為空白對照組?；熕幬镯樸K（Cisplatin，DDP）設(shè)置不同濃度梯度分別處理上述三組細(xì)胞24h。分光光度計(jì)檢測24h時(shí)的各組OD值。計(jì)算各組細(xì)

3、胞的增殖抑制率及半數(shù)抑制濃度（IC50）值。
　　3.通過Annexin-V、PI雙標(biāo)的凋亡試劑檢測法，分別檢測經(jīng)順鉑處理的Hep2/Nrf2-siRNA、Hep2/control-siRNA、未轉(zhuǎn)染Hep2三組細(xì)胞的凋亡率。熒光顯微鏡觀察各組細(xì)胞凋亡情況。
　　4.以慢病毒為載體，將shRNA-SENP3目的基因轉(zhuǎn)染喉癌Hep2細(xì)胞，Western Blot檢測shRNA對SENP3的抑制效率。同時(shí)WB法檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)敲除SEN

4、P3的Hep2細(xì)胞中Nrf2、HO-1表達(dá)。
　　5. CCK-8比色法行細(xì)胞增殖-毒性實(shí)驗(yàn)，檢測Hep2/shRNA-SENP3與對照組增殖抑制率差異。
　　結(jié)果：
　　1.siRNA干擾Nrf2表達(dá)后，不同濃度下順鉑對Hep2細(xì)胞的增殖抑制率均較對照組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而其IC50值（5.27μg/ml）也低于對照組細(xì)胞。
　　2.AnnexinV/PI雙標(biāo)檢測細(xì)胞凋亡率，順鉑同時(shí)處理細(xì)胞24h，Hep

5、2/Nrf2-siRNA組凋亡率較對照組增加。提示下調(diào)Nrf2表達(dá)增強(qiáng)了順鉑的促凋亡作用。
　　3.建立穩(wěn)定低表達(dá)SENP3的Hep2，Western Blot檢測Nrf2、HO-1表達(dá)均出現(xiàn)下調(diào)。順鉑對敲除SENP3的穩(wěn)轉(zhuǎn)株Hep2抑制作用較對照組增強(qiáng)。
　　結(jié)論：
　　下調(diào)Nrf2表達(dá)可增強(qiáng)Hep2對順鉑的化療敏感性，并增強(qiáng)其促凋亡作用。敲除Hep2中SENP3基因，可下調(diào)Nrf2-ARE信號通路，而增強(qiáng)了其化療敏