轉(zhuǎn)基因和基因敲入小鼠前列腺癌模型的實(shí)驗(yàn)研究和多價(jià)抗前列腺癌單鏈抗體的制備.pdf

1、目的：前列腺癌是男性特有的腫瘤。小鼠中沒有自然發(fā)生的前列腺癌，利用基因工程技術(shù)建立小鼠前列腺癌模型對臨床前期前列腺癌的研究具有至關(guān)重要的意義。最近，利用前列腺分泌性蛋白94氨基酸(PSP94)啟動(dòng)子建立了轉(zhuǎn)基因前列腺癌小鼠模型(TGMAP)和基因敲入前列腺癌小鼠模型(KIMAP)，后者尤其顯示了與人類相近的腫瘤特征。本課題利用與臨床Gleason分級系統(tǒng)相近的小鼠組織學(xué)分級系統(tǒng)、流式細(xì)胞儀和基因芯片技術(shù)，分析比較了KIMAP模型與人類前

2、列腺癌和TGMAP模型。本課題首次應(yīng)用三維超聲微成像監(jiān)測TGMAP模型小鼠的前列腺腫瘤生長，建立小鼠前列腺癌的血清學(xué)腫瘤標(biāo)志物PSP94檢測系統(tǒng)。為了提高以往構(gòu)建的抗人γ-精漿蛋白(γ-Sm)單鏈抗體(scFv)的親和活性，我們應(yīng)用人p53四聚功能域基因構(gòu)建了四價(jià)scFv，并進(jìn)行真核表達(dá)和活性測定。 方法：①依照前列腺癌臨床診斷的Gleason五級10分制的組織學(xué)分級和評分標(biāo)準(zhǔn)，建立了基因工程小鼠模型的分析標(biāo)準(zhǔn)。對96例KIMA

3、P和44例TGMAP前列腺癌標(biāo)本進(jìn)行了分析，并與臨床前列腺癌進(jìn)行了比較。對于來自KIMAP和TGMAP的腫瘤標(biāo)本進(jìn)行了流式細(xì)胞儀和基因芯片分析。②應(yīng)用三維超聲微成像系統(tǒng)監(jiān)測了TGMAP模型小鼠的前列腺腫瘤生長。通過對TGMAP小鼠前列腺癌的三維超聲圖像和前列腺癌標(biāo)本的連續(xù)切片定性比較，驗(yàn)證該超聲系統(tǒng)檢測活體小鼠腫瘤大小和形狀的可靠性。③為了建立小鼠前列腺癌血清學(xué)腫瘤標(biāo)志物PSP94檢測系統(tǒng)，我們制備了抗重組小鼠PSP94的多克隆抗體，并

4、對來自兩種小鼠模型的不同組織學(xué)分級的前列腺癌標(biāo)本進(jìn)行了免疫組化分析。建立了競爭ELISA方法測量小鼠血清PSP94水平，并監(jiān)測去勢小鼠(雄激素去除治療)的血清PSP94變化。④利用遞歸PCR法擴(kuò)增IgG3上游鉸鏈區(qū)與p53四聚功能域融合基因，克隆入pUC19載體中構(gòu)建pUC19/IgG3/p53克隆載體。將抗γ-SmscFv克隆入該載體中，構(gòu)建抗γ-SmscFv/p53四聚功能域融合基因，并克隆入真核表達(dá)載體pSecTag2-B，轉(zhuǎn)染H

5、eLa細(xì)胞表達(dá)純化后，利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行活性測定。 結(jié)果：①來源于TGMAP(n=前列腺癌44例/總數(shù)187例)和KIMAP(n=前列腺癌96例/總數(shù)169例)的前列腺癌小鼠表現(xiàn)了不同的組織學(xué)評分的分布(p=0.000)。KIMAP小鼠(52.1％)比TGMAP小鼠(25.0％)表現(xiàn)出更高的混合組織學(xué)評分率，更接近于臨床平均值(50.0％)，腫瘤浸潤前列腺范圍的平衡分布與年齡顯著相關(guān)(p=0.001)，而TGMAP小鼠在所有年齡

6、組均顯示出不平衡的和隨意的組織學(xué)評分分布。流式細(xì)胞儀分析顯示多數(shù)KIMAP腫瘤為雙倍體，與臨床相近，而所有TGMAP腫瘤均為非整倍體。基因芯片分析證明，在KIMAP中免疫應(yīng)答基因高表達(dá)，而TGMAP晚期腫瘤(26-32周)中與神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(NE)分化相關(guān)的基因占主體，而NE腫瘤在人類前列腺癌中少于10％。多數(shù)晚期(1年)的KIMAP小鼠不進(jìn)展為NE癌和小細(xì)胞癌，只在極晚期(75-92周)可見且頻率低(2/36)。人類前列腺癌的幾個(gè)腫瘤

7、標(biāo)記物基因在KIMAP中均可檢測到(在TGMAP中缺乏)，包括hepsin、maspin、Nkx3.1、CD10和PSP94等。②通過定性比較前列腺癌的三維超聲成像與連續(xù)組織學(xué)切片，證實(shí)了該超聲系統(tǒng)可以準(zhǔn)確顯示活體小鼠腫瘤的大小和形狀。超聲成像可檢測到直徑在2.4-14mm的腫瘤。通過三維超聲體內(nèi)測量和尸檢獲得的腫瘤最大直徑的相關(guān)性為0.998，超聲診斷的敏感性和特異性均＞90％。通過動(dòng)態(tài)超聲監(jiān)測結(jié)果繪制的指數(shù)生長曲線顯示兩只小鼠的腫瘤

8、體積倍增時(shí)間分別為5天和13天。③在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，與人類PSP94不同，小鼠PSP94是糖基化的蛋白。對KIMAP和TGMAP模型的不同組織分級腫瘤的免疫組織化學(xué)研究表明，與人類前列腺特異抗原(PSA)和PSP94相同，小鼠PSP94表達(dá)下調(diào)(p＜0.001)。用小鼠PSP94多克隆抗體親和層析柱的方法純化并證實(shí)小鼠血清內(nèi)存在PSP94。建立競爭ELISA方法，并以1ng/ml的靈敏度定量檢測血清PSP94水平。野生型小鼠PSP94

9、血清平均水平為50.0ng/ml，對于20周齡、40周齡和＞40周齡的前列腺癌小鼠模型分別為150.0、825.5和774.8ng/ml。血清PSP94的升高與小鼠腫瘤分級有著良好的相關(guān)性(p=0.000，n=68)。通過對去勢小鼠血清PSP94水平的連續(xù)監(jiān)測，我們發(fā)現(xiàn)前列腺組織對激素的反應(yīng)性/抵抗性與血清PSP94水平相關(guān)。三維超聲成像進(jìn)一步證實(shí)小鼠血清PSP94在激素治療中可作為標(biāo)志物。④獲得了抗人γ-SmscFv/p53四聚功能域

10、融合基因，基因全長891bp，可編碼297個(gè)氨基酸。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE和Western印跡實(shí)驗(yàn)證實(shí)為約35kD的特異蛋白條帶，純化后經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測可以特異性地結(jié)合PC-3細(xì)胞，親和力高于scFv。 結(jié)論：①由于KIMAP模型成功地模仿了人類前列腺癌特征，在前列腺癌臨床前期研究中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。②小鼠前列腺癌模型的三維超聲微成像具有諸多優(yōu)點(diǎn)，如：空間分辨率高、與軟組織的對比強(qiáng)、操作快速簡易、設(shè)備便宜可攜帶等，有望成為