轉(zhuǎn)基因和基因敲入小鼠前列腺癌模型的實驗研究和多價抗前列腺癌單鏈抗體的制備.pdf

1、目的：前列腺癌是男性特有的腫瘤。小鼠中沒有自然發(fā)生的前列腺癌，利用基因工程技術(shù)建立小鼠前列腺癌模型對臨床前期前列腺癌的研究具有至關(guān)重要的意義。最近，利用前列腺分泌性蛋白94氨基酸(PSP94)啟動子建立了轉(zhuǎn)基因前列腺癌小鼠模型(TGMAP)和基因敲入前列腺癌小鼠模型(KIMAP)，后者尤其顯示了與人類相近的腫瘤特征。本課題利用與臨床Gleason分級系統(tǒng)相近的小鼠組織學(xué)分級系統(tǒng)、流式細胞儀和基因芯片技術(shù)，分析比較了KIMAP模型與人類前

2、列腺癌和TGMAP模型。本課題首次應(yīng)用三維超聲微成像監(jiān)測TGMAP模型小鼠的前列腺腫瘤生長，建立小鼠前列腺癌的血清學(xué)腫瘤標(biāo)志物PSP94檢測系統(tǒng)。為了提高以往構(gòu)建的抗人γ-精漿蛋白(γ-Sm)單鏈抗體(scFv)的親和活性，我們應(yīng)用人p53四聚功能域基因構(gòu)建了四價scFv，并進行真核表達和活性測定。 方法：①依照前列腺癌臨床診斷的Gleason五級10分制的組織學(xué)分級和評分標(biāo)準(zhǔn)，建立了基因工程小鼠模型的分析標(biāo)準(zhǔn)。對96例KIMA

3、P和44例TGMAP前列腺癌標(biāo)本進行了分析，并與臨床前列腺癌進行了比較。對于來自KIMAP和TGMAP的腫瘤標(biāo)本進行了流式細胞儀和基因芯片分析。②應(yīng)用三維超聲微成像系統(tǒng)監(jiān)測了TGMAP模型小鼠的前列腺腫瘤生長。通過對TGMAP小鼠前列腺癌的三維超聲圖像和前列腺癌標(biāo)本的連續(xù)切片定性比較，驗證該超聲系統(tǒng)檢測活體小鼠腫瘤大小和形狀的可靠性。③為了建立小鼠前列腺癌血清學(xué)腫瘤標(biāo)志物PSP94檢測系統(tǒng)，我們制備了抗重組小鼠PSP94的多克隆抗體，并

4、對來自兩種小鼠模型的不同組織學(xué)分級的前列腺癌標(biāo)本進行了免疫組化分析。建立了競爭ELISA方法測量小鼠血清PSP94水平，并監(jiān)測去勢小鼠(雄激素去除治療)的血清PSP94變化。④利用遞歸PCR法擴增IgG3上游鉸鏈區(qū)與p53四聚功能域融合基因，克隆入pUC19載體中構(gòu)建pUC19/IgG3/p53克隆載體。將抗γ-SmscFv克隆入該載體中，構(gòu)建抗γ-SmscFv/p53四聚功能域融合基因，并克隆入真核表達載體pSecTag2-B，轉(zhuǎn)染H

5、eLa細胞表達純化后，利用流式細胞儀進行活性測定。 結(jié)果：①來源于TGMAP(n=前列腺癌44例/總數(shù)187例)和KIMAP(n=前列腺癌96例/總數(shù)169例)的前列腺癌小鼠表現(xiàn)了不同的組織學(xué)評分的分布(p=0.000)。KIMAP小鼠(52.1％)比TGMAP小鼠(25.0％)表現(xiàn)出更高的混合組織學(xué)評分率，更接近于臨床平均值(50.0％)，腫瘤浸潤前列腺范圍的平衡分布與年齡顯著相關(guān)(p=0.001)，而TGMAP小鼠在所有年齡

6、組均顯示出不平衡的和隨意的組織學(xué)評分分布。流式細胞儀分析顯示多數(shù)KIMAP腫瘤為雙倍體，與臨床相近，而所有TGMAP腫瘤均為非整倍體?；蛐酒治鲎C明，在KIMAP中免疫應(yīng)答基因高表達，而TGMAP晚期腫瘤(26-32周)中與神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(NE)分化相關(guān)的基因占主體，而NE腫瘤在人類前列腺癌中少于10％。多數(shù)晚期(1年)的KIMAP小鼠不進展為NE癌和小細胞癌，只在極晚期(75-92周)可見且頻率低(2/36)。人類前列腺癌的幾個腫瘤

7、標(biāo)記物基因在KIMAP中均可檢測到(在TGMAP中缺乏)，包括hepsin、maspin、Nkx3.1、CD10和PSP94等。②通過定性比較前列腺癌的三維超聲成像與連續(xù)組織學(xué)切片，證實了該超聲系統(tǒng)可以準(zhǔn)確顯示活體小鼠腫瘤的大小和形狀。超聲成像可檢測到直徑在2.4-14mm的腫瘤。通過三維超聲體內(nèi)測量和尸檢獲得的腫瘤最大直徑的相關(guān)性為0.998，超聲診斷的敏感性和特異性均＞90％。通過動態(tài)超聲監(jiān)測結(jié)果繪制的指數(shù)生長曲線顯示兩只小鼠的腫瘤

8、體積倍增時間分別為5天和13天。③在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，與人類PSP94不同，小鼠PSP94是糖基化的蛋白。對KIMAP和TGMAP模型的不同組織分級腫瘤的免疫組織化學(xué)研究表明，與人類前列腺特異抗原(PSA)和PSP94相同，小鼠PSP94表達下調(diào)(p＜0.001)。用小鼠PSP94多克隆抗體親和層析柱的方法純化并證實小鼠血清內(nèi)存在PSP94。建立競爭ELISA方法，并以1ng/ml的靈敏度定量檢測血清PSP94水平。野生型小鼠PSP94

9、血清平均水平為50.0ng/ml，對于20周齡、40周齡和＞40周齡的前列腺癌小鼠模型分別為150.0、825.5和774.8ng/ml。血清PSP94的升高與小鼠腫瘤分級有著良好的相關(guān)性(p=0.000，n=68)。通過對去勢小鼠血清PSP94水平的連續(xù)監(jiān)測，我們發(fā)現(xiàn)前列腺組織對激素的反應(yīng)性/抵抗性與血清PSP94水平相關(guān)。三維超聲成像進一步證實小鼠血清PSP94在激素治療中可作為標(biāo)志物。④獲得了抗人γ-SmscFv/p53四聚功能域

10、融合基因，基因全長891bp，可編碼297個氨基酸。表達產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE和Western印跡實驗證實為約35kD的特異蛋白條帶，純化后經(jīng)流式細胞儀檢測可以特異性地結(jié)合PC-3細胞，親和力高于scFv。 結(jié)論：①由于KIMAP模型成功地模仿了人類前列腺癌特征，在前列腺癌臨床前期研究中具有潛在的應(yīng)用價值。②小鼠前列腺癌模型的三維超聲微成像具有諸多優(yōu)點，如：空間分辨率高、與軟組織的對比強、操作快速簡易、設(shè)備便宜可攜帶等，有望成為