HIV-1進(jìn)入抑制劑的篩選和T-20作用機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景：
　　 艾滋病(AIDS)是由人免疫缺陷病毒(HIV)感染引起的,目前在全球已呈爆發(fā)性流行趨勢。艾滋病防治最好的手段應(yīng)是疫苗。但二十多年來,還沒有一個(gè)HIV疫苗的臨床方案被證明為有效。在今后相當(dāng)長的一段時(shí)期內(nèi),有效的HIV疫苗恐難有重大突破。因此,發(fā)展安全有效的抗艾滋病藥物,依然是當(dāng)前艾滋病預(yù)防和治療的重點(diǎn)。
　　 迄今為止,已有三大類28種抗HIV藥物被美國FDA批準(zhǔn)用于臨床,分別是逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑,蛋白酶抑制

2、劑和HIV進(jìn)入抑制劑。前兩類藥物易誘導(dǎo)HIV耐藥性突變,而且對人體有較大的毒副作用,導(dǎo)致越來越多的艾滋病患者無法持續(xù)地接受抗HIV藥物的治療。而HIV進(jìn)入抑制劑,盡管目前僅有T-20和Maraviroc兩種,但它們對耐受前兩類抗HIV藥物的病毒依然有效,并可組成更多的“雞尾酒”方案,用于艾滋病的治療。
　　 高通量藥物篩選是當(dāng)前新藥發(fā)現(xiàn)的手段之一。自從20世紀(jì)90年代Jiang等發(fā)現(xiàn)第一個(gè)來自HIV-1gp41C-末端重復(fù)序列的

3、HIV-1進(jìn)入抑制劑以來,本實(shí)驗(yàn)室曾建立了一系列篩選HIV-1進(jìn)入抑制劑的方法,并且采用這些方法發(fā)現(xiàn)了一系列靶向HIV-1gp41的融合抑制劑和靶向HIV-1gp120的粘附抑制劑。但是,由于HIV-1病毒具有傳染性強(qiáng)、致病性高等特點(diǎn),對該病毒只限于在生物安全級別三級(P3)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行,不便于廣泛深入的開展研究,所以建立適用于普通實(shí)驗(yàn)室篩選HIV-1進(jìn)入抑制劑高通量藥物篩選的方法,對于開發(fā)抗HIV-1新藥顯得尤為重要。
　　

4、我們課題組此前的研究表明,T-20的作用機(jī)制和C34并不相同,它不能與N-多肽形成六螺旋束結(jié)構(gòu),也不能阻止C34與N-多肽形成六螺旋束結(jié)構(gòu),它可能具有多個(gè)功能區(qū)。但是它具體的作用機(jī)制并不清楚。通過全序列多肽掃描,我們曾發(fā)現(xiàn)衍生至X4病毒株HIV-1MN gp120的輔助受體結(jié)合部位和gp41跨膜區(qū)段的15-mer多肽,能消除T-20的抑制活性,表明T-20抗HIV的作用位點(diǎn)還包括gp120上的CXCR4輔助受體結(jié)合部位。那T-20與gp

5、120的CXCR4結(jié)合位點(diǎn)相互作用的關(guān)鍵序列是什么?T-20是否能結(jié)合到gp120-CD4復(fù)合物上的CCR5輔助受體結(jié)合位點(diǎn)?深入研究T-20的新作用機(jī)制,將可能為HIV進(jìn)入抑制劑的研究提供新的藥物作用靶點(diǎn)。
　　 為此,本課題根據(jù)我們在HIV-1病毒進(jìn)入抑制劑研究領(lǐng)域積累的經(jīng)驗(yàn),以HIV-1假病毒作為研究對象,為確認(rèn)HIV-1進(jìn)入抑制劑新的藥物作用靶點(diǎn)以及建立相應(yīng)的高通量篩選方法,尋找替代多肽藥物T-20的小分子化合物奠定研究

6、基礎(chǔ)。(1)建立一種非感染性的細(xì)胞融合的方法:根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室積累的建立非感染性高通量篩選方法的經(jīng)驗(yàn),分別用HL2/3細(xì)胞和Hela-ED4-LTR/β-gal作為效應(yīng)物和靶細(xì)胞,通過對β-半乳糖甘酶染色來判斷細(xì)胞融合的效果。由于本方法具有非感染性,再結(jié)合基于細(xì)胞融合的非感染性的CHO-WT方法,可以在普通實(shí)驗(yàn)室用來快速篩選HIV-1融合抑制劑和Tat蛋白抑制劑。(2)天然來源的抗HIV-1藥物篩選:利用假病毒體系和針對包膜蛋白亞基gp41

7、的ELISA方法,結(jié)合分子對接,擬對來源于馬尾樹樹皮的化合物蠟果楊梅酸B、日本蛇菰地上地下部分的葡萄糖類化合物和白樺酯酸衍生物等活性化合物抗HIV-1的作用機(jī)理。(3)T-20與gp120的關(guān)系的研究:擬合成覆蓋409-431序列5個(gè)8-mer多肽(每個(gè)多肽相隔3個(gè)氨基酸殘基),尋找消除T-20抑制活性的關(guān)鍵序列以及與T-20相互作用的關(guān)鍵序列。并且建立HIV-1假病毒感染U87.CD4.CXCR4細(xì)胞的活性檢測方法,并篩選小分子化合物

8、庫,尋找能有效抑制HIV-1 env進(jìn)入靶細(xì)胞的活性分子,為開發(fā)病毒進(jìn)入抑制劑類抗HIV-1藥物提供新的思路。
　　 目的：
　　 1、根據(jù)HIV-1進(jìn)入和復(fù)制的兩個(gè)關(guān)鍵步驟,即病毒包膜蛋白介導(dǎo)的病毒-細(xì)胞膜融合和Tat-LTR的相互作用,擬建立一種非感染性的細(xì)胞融合的方法來同時(shí)快速篩選HIV-1融合抑制劑和Tat-LTR抑制劑。
　　 2、建立HIV-1假病毒細(xì)胞篩選模型,以及HIV-1假病毒感染U87.CD4

9、.CXCR4細(xì)胞的活性檢測方法,并篩選小分子化合物庫,尋找能有效抑制HIV-1 env進(jìn)入靶細(xì)胞的活性分子,研究活性小分子化合物的具體作用機(jī)制。
　　 3、深入研究T-20的具體作用機(jī)制,尋找HIV進(jìn)入抑制劑新的藥物作用靶點(diǎn)。
　　 方法:
　　 1、分別用HL2/3細(xì)胞和Hela-CD4-LTR/β-gal.作為效應(yīng)物和靶細(xì)胞。當(dāng)HL2/3細(xì)胞和Hela-CD4-LTR/β-gal細(xì)胞結(jié)合后,HL2/3中的Ta

10、t蛋白可以啟動(dòng)β-半乳糖甘酶長末端的LTR的表達(dá),進(jìn)一步導(dǎo)致了β-半乳糖甘酶的表達(dá)。因此可以通過對β-半乳糖甘酶染色來判斷細(xì)胞融合的效果。
　　 2、建立細(xì)胞水平的HIV-1假病毒活性檢測方法:將包膜蛋白質(zhì)粒(pHXB2或VSV-G)與pNL4,3,Luc.R-E-(帶有熒光素酶報(bào)告基因的HIV-1基因)共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞后,可分別獲得HIV-1 env假病毒和VSV-G假病毒。
　　 3、抗HIV-1活性篩選:應(yīng)用U

11、87.CD4.CXCR4細(xì)胞作為篩選模型,利用假病毒體系和針對包膜蛋白亞基gp41的ELISA方法,結(jié)合分子對接,研究來源于馬尾樹樹皮的化合物蠟果楊梅酸B、日本蛇菰地上地下部分的葡萄糖類化合物和白樺酯酸衍生物等活性化合物抗HIV-1的作用機(jī)理。
　　 4、合成覆蓋409-431序列的5個(gè)8-mer多肽(每個(gè)多肽相隔3個(gè)氨基酸殘基),尋找消除T-20抑制活性的關(guān)鍵序列以及與T-20相互作用的關(guān)鍵序列。構(gòu)建相應(yīng)的X4假病毒,檢測T-

12、20抑制這些x4假病毒與靶細(xì)胞融合的活性。
　　 結(jié)果:
　　 1、HIV進(jìn)入抑制劑高通量篩選方法的建立
　　 1)HeLa-CD4-LTR-β-gal細(xì)胞與HL2/3細(xì)胞共孵育后導(dǎo)致了β-半乳糖甘酶的表達(dá)。HIV-1融合抑制劑(T-20、C34和ADS-J1)可以抑制表達(dá)了HIV-1包膜蛋白的HL2/3細(xì)胞和表達(dá)了β-半乳糖甘酶的HeLa-CD4-LTR-β-gal細(xì)胞的融合。兩種Tat蛋白抑制劑姜黃素和氯丙嗪

13、也可以抑制HL2/3細(xì)胞和HeLa-CD4-LTR-β-gal細(xì)胞的融合。
　　 2)CHO-WT和MT-2細(xì)胞共孵育后導(dǎo)致了大量融合泡的產(chǎn)生。HIV-1融合抑制劑(T-20、C34和ADS-J1)可以抑制穩(wěn)定表達(dá)HIV-1包膜蛋白gp160的CHO/WT細(xì)胞株和含有表達(dá)CD4受體分子和CXCR4輔助受體的MT-2細(xì)胞之間融合泡的產(chǎn)生。兩種Tat蛋白抑制劑姜黃素和氯丙嗪并不能抑制細(xì)胞之間融合泡的
　　 產(chǎn)生。
　　

14、 2、天然來源的抗HIV-1化合物篩選
　　 1)從馬尾樹樹皮中提取蠟果楊梅酸B(myriceric acid B)能抑制HIV-1 env假病毒感染,其半數(shù)抑制濃度(IC50)值為是8.3±0.2 μg·ml-1。其抑制活性與其抑制gp41六螺旋束結(jié)構(gòu)形成的機(jī)制有關(guān),并且能靶向gp41上N-螺旋三聚體的靶穴位置。
　　 2)來源于日本蛇菰地上地下部分的咖啡酰葡萄糖類化合物,1,2,6-三-O-咖啡酰基-β-D-吡喃葡

15、萄糖和1,3-雙-O-咖啡?；?4-O-沒食子酰-β-D-吡喃葡萄糖具有較好抑制病毒的作用。它們的半數(shù)抑制濃度(IC50)值分別是5.5±0.2μg·ml-1和5.3±0.1 μg·ml-1。這2種化合物的抑制活性與其抑制gp41六螺旋束結(jié)構(gòu)形成的機(jī)制有關(guān)。它們均能靶向gp41上N-螺旋三聚體的靶穴位置。
　　 3)白樺酯酸衍生物L(fēng)Y7和LY14能夠抑制HIV env假病毒,它們的半數(shù)抑制濃度(IC50)值分別為7.96±1.5

16、4μg·ml-1和5.67±0.40μg·ml-1。
　　 3、T-20作用機(jī)制的研究
　　 1)衍生于gp120的系列多肽(MN-6312,MN-6313,SW-1012,SW-1013)能夠逆轉(zhuǎn)T-20對HIV env的抑制作用。
　　 2)衍生于gp120的多肽SW-1011對U87.CD4.CXCR4具有細(xì)胞毒性,CC50值為5.92±1.53μM
　　 3)SW-1010與T-20不能直接結(jié)合。

17、Biotin-6312并不能和衍生gp41的系列多肽作用。
　　 4)衍生于gp120的系列多肽(MN-6312,MN-6313,SW-1010,SW-1012)能夠促進(jìn)HIV env pseudovirus感染,但是它們對VSV-G pseudovirus均無促進(jìn)作用。
　　 結(jié)論:
　　 1.由于實(shí)驗(yàn)中采用的細(xì)胞融合體系都是非感染性的,可以在普通實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用。
　　 2.蠟果楊梅酸B是作用于gp41的H

18、IV-1進(jìn)入抑制劑,可作為先導(dǎo)化合物來研發(fā)抗HIV-1新藥。
　　 3.1,2,6-三-O-咖啡?；?β-D-吡喃葡萄糖和1,3-雙-O-咖啡?；?4-O-沒食子酰-β-D-吡喃葡萄糖可以較好的抑制HIV-1 env假病毒感染靶細(xì)胞,可作為先導(dǎo)化合物來研發(fā)抗HIV-1新藥。
　　 4.白樺酯酸衍生物L(fēng)Y7和LY14能夠抑制HIV env假病毒,可作為先導(dǎo)化合物來研發(fā)抗HIV-1新藥。
　　 5.T-20不能和gp