HIV-1進入抑制劑的篩選和T-20作用機制的研究.pdf

1、研究背景：
　　 艾滋病(AIDS)是由人免疫缺陷病毒(HIV)感染引起的,目前在全球已呈爆發(fā)性流行趨勢。艾滋病防治最好的手段應是疫苗。但二十多年來,還沒有一個HIV疫苗的臨床方案被證明為有效。在今后相當長的一段時期內,有效的HIV疫苗恐難有重大突破。因此,發(fā)展安全有效的抗艾滋病藥物,依然是當前艾滋病預防和治療的重點。
　　 迄今為止,已有三大類28種抗HIV藥物被美國FDA批準用于臨床,分別是逆轉錄酶抑制劑,蛋白酶抑制

2、劑和HIV進入抑制劑。前兩類藥物易誘導HIV耐藥性突變,而且對人體有較大的毒副作用,導致越來越多的艾滋病患者無法持續(xù)地接受抗HIV藥物的治療。而HIV進入抑制劑,盡管目前僅有T-20和Maraviroc兩種,但它們對耐受前兩類抗HIV藥物的病毒依然有效,并可組成更多的“雞尾酒”方案,用于艾滋病的治療。
　　 高通量藥物篩選是當前新藥發(fā)現的手段之一。自從20世紀90年代Jiang等發(fā)現第一個來自HIV-1gp41C-末端重復序列的

3、HIV-1進入抑制劑以來,本實驗室曾建立了一系列篩選HIV-1進入抑制劑的方法,并且采用這些方法發(fā)現了一系列靶向HIV-1gp41的融合抑制劑和靶向HIV-1gp120的粘附抑制劑。但是,由于HIV-1病毒具有傳染性強、致病性高等特點,對該病毒只限于在生物安全級別三級(P3)實驗室內進行,不便于廣泛深入的開展研究,所以建立適用于普通實驗室篩選HIV-1進入抑制劑高通量藥物篩選的方法,對于開發(fā)抗HIV-1新藥顯得尤為重要。
　　

4、我們課題組此前的研究表明,T-20的作用機制和C34并不相同,它不能與N-多肽形成六螺旋束結構,也不能阻止C34與N-多肽形成六螺旋束結構,它可能具有多個功能區(qū)。但是它具體的作用機制并不清楚。通過全序列多肽掃描,我們曾發(fā)現衍生至X4病毒株HIV-1MN gp120的輔助受體結合部位和gp41跨膜區(qū)段的15-mer多肽,能消除T-20的抑制活性,表明T-20抗HIV的作用位點還包括gp120上的CXCR4輔助受體結合部位。那T-20與gp

5、120的CXCR4結合位點相互作用的關鍵序列是什么?T-20是否能結合到gp120-CD4復合物上的CCR5輔助受體結合位點?深入研究T-20的新作用機制,將可能為HIV進入抑制劑的研究提供新的藥物作用靶點。
　　 為此,本課題根據我們在HIV-1病毒進入抑制劑研究領域積累的經驗,以HIV-1假病毒作為研究對象,為確認HIV-1進入抑制劑新的藥物作用靶點以及建立相應的高通量篩選方法,尋找替代多肽藥物T-20的小分子化合物奠定研究

6、基礎。(1)建立一種非感染性的細胞融合的方法:根據本實驗室積累的建立非感染性高通量篩選方法的經驗,分別用HL2/3細胞和Hela-ED4-LTR/β-gal作為效應物和靶細胞,通過對β-半乳糖甘酶染色來判斷細胞融合的效果。由于本方法具有非感染性,再結合基于細胞融合的非感染性的CHO-WT方法,可以在普通實驗室用來快速篩選HIV-1融合抑制劑和Tat蛋白抑制劑。(2)天然來源的抗HIV-1藥物篩選:利用假病毒體系和針對包膜蛋白亞基gp41

7、的ELISA方法,結合分子對接,擬對來源于馬尾樹樹皮的化合物蠟果楊梅酸B、日本蛇菰地上地下部分的葡萄糖類化合物和白樺酯酸衍生物等活性化合物抗HIV-1的作用機理。(3)T-20與gp120的關系的研究:擬合成覆蓋409-431序列5個8-mer多肽(每個多肽相隔3個氨基酸殘基),尋找消除T-20抑制活性的關鍵序列以及與T-20相互作用的關鍵序列。并且建立HIV-1假病毒感染U87.CD4.CXCR4細胞的活性檢測方法,并篩選小分子化合物

8、庫,尋找能有效抑制HIV-1 env進入靶細胞的活性分子,為開發(fā)病毒進入抑制劑類抗HIV-1藥物提供新的思路。
　　 目的：
　　 1、根據HIV-1進入和復制的兩個關鍵步驟,即病毒包膜蛋白介導的病毒-細胞膜融合和Tat-LTR的相互作用,擬建立一種非感染性的細胞融合的方法來同時快速篩選HIV-1融合抑制劑和Tat-LTR抑制劑。
　　 2、建立HIV-1假病毒細胞篩選模型,以及HIV-1假病毒感染U87.CD4

9、.CXCR4細胞的活性檢測方法,并篩選小分子化合物庫,尋找能有效抑制HIV-1 env進入靶細胞的活性分子,研究活性小分子化合物的具體作用機制。
　　 3、深入研究T-20的具體作用機制,尋找HIV進入抑制劑新的藥物作用靶點。
　　 方法:
　　 1、分別用HL2/3細胞和Hela-CD4-LTR/β-gal.作為效應物和靶細胞。當HL2/3細胞和Hela-CD4-LTR/β-gal細胞結合后,HL2/3中的Ta

10、t蛋白可以啟動β-半乳糖甘酶長末端的LTR的表達,進一步導致了β-半乳糖甘酶的表達。因此可以通過對β-半乳糖甘酶染色來判斷細胞融合的效果。
　　 2、建立細胞水平的HIV-1假病毒活性檢測方法:將包膜蛋白質粒(pHXB2或VSV-G)與pNL4,3,Luc.R-E-(帶有熒光素酶報告基因的HIV-1基因)共轉染至293T細胞后,可分別獲得HIV-1 env假病毒和VSV-G假病毒。
　　 3、抗HIV-1活性篩選:應用U

11、87.CD4.CXCR4細胞作為篩選模型,利用假病毒體系和針對包膜蛋白亞基gp41的ELISA方法,結合分子對接,研究來源于馬尾樹樹皮的化合物蠟果楊梅酸B、日本蛇菰地上地下部分的葡萄糖類化合物和白樺酯酸衍生物等活性化合物抗HIV-1的作用機理。
　　 4、合成覆蓋409-431序列的5個8-mer多肽(每個多肽相隔3個氨基酸殘基),尋找消除T-20抑制活性的關鍵序列以及與T-20相互作用的關鍵序列。構建相應的X4假病毒,檢測T-

12、20抑制這些x4假病毒與靶細胞融合的活性。
　　 結果:
　　 1、HIV進入抑制劑高通量篩選方法的建立
　　 1)HeLa-CD4-LTR-β-gal細胞與HL2/3細胞共孵育后導致了β-半乳糖甘酶的表達。HIV-1融合抑制劑(T-20、C34和ADS-J1)可以抑制表達了HIV-1包膜蛋白的HL2/3細胞和表達了β-半乳糖甘酶的HeLa-CD4-LTR-β-gal細胞的融合。兩種Tat蛋白抑制劑姜黃素和氯丙嗪

13、也可以抑制HL2/3細胞和HeLa-CD4-LTR-β-gal細胞的融合。
　　 2)CHO-WT和MT-2細胞共孵育后導致了大量融合泡的產生。HIV-1融合抑制劑(T-20、C34和ADS-J1)可以抑制穩(wěn)定表達HIV-1包膜蛋白gp160的CHO/WT細胞株和含有表達CD4受體分子和CXCR4輔助受體的MT-2細胞之間融合泡的產生。兩種Tat蛋白抑制劑姜黃素和氯丙嗪并不能抑制細胞之間融合泡的
　　 產生。
　　

14、 2、天然來源的抗HIV-1化合物篩選
　　 1)從馬尾樹樹皮中提取蠟果楊梅酸B(myriceric acid B)能抑制HIV-1 env假病毒感染,其半數抑制濃度(IC50)值為是8.3±0.2 μg·ml-1。其抑制活性與其抑制gp41六螺旋束結構形成的機制有關,并且能靶向gp41上N-螺旋三聚體的靶穴位置。
　　 2)來源于日本蛇菰地上地下部分的咖啡酰葡萄糖類化合物,1,2,6-三-O-咖啡?；?β-D-吡喃葡

15、萄糖和1,3-雙-O-咖啡?；?4-O-沒食子酰-β-D-吡喃葡萄糖具有較好抑制病毒的作用。它們的半數抑制濃度(IC50)值分別是5.5±0.2μg·ml-1和5.3±0.1 μg·ml-1。這2種化合物的抑制活性與其抑制gp41六螺旋束結構形成的機制有關。它們均能靶向gp41上N-螺旋三聚體的靶穴位置。
　　 3)白樺酯酸衍生物LY7和LY14能夠抑制HIV env假病毒,它們的半數抑制濃度(IC50)值分別為7.96±1.5

16、4μg·ml-1和5.67±0.40μg·ml-1。
　　 3、T-20作用機制的研究
　　 1)衍生于gp120的系列多肽(MN-6312,MN-6313,SW-1012,SW-1013)能夠逆轉T-20對HIV env的抑制作用。
　　 2)衍生于gp120的多肽SW-1011對U87.CD4.CXCR4具有細胞毒性,CC50值為5.92±1.53μM
　　 3)SW-1010與T-20不能直接結合。

17、Biotin-6312并不能和衍生gp41的系列多肽作用。
　　 4)衍生于gp120的系列多肽(MN-6312,MN-6313,SW-1010,SW-1012)能夠促進HIV env pseudovirus感染,但是它們對VSV-G pseudovirus均無促進作用。
　　 結論:
　　 1.由于實驗中采用的細胞融合體系都是非感染性的,可以在普通實驗室應用。
　　 2.蠟果楊梅酸B是作用于gp41的H

18、IV-1進入抑制劑,可作為先導化合物來研發(fā)抗HIV-1新藥。
　　 3.1,2,6-三-O-咖啡酰基-β-D-吡喃葡萄糖和1,3-雙-O-咖啡?；?4-O-沒食子酰-β-D-吡喃葡萄糖可以較好的抑制HIV-1 env假病毒感染靶細胞,可作為先導化合物來研發(fā)抗HIV-1新藥。
　　 4.白樺酯酸衍生物LY7和LY14能夠抑制HIV env假病毒,可作為先導化合物來研發(fā)抗HIV-1新藥。
　　 5.T-20不能和gp