P53抑制劑誘導大鼠骨髓間充質干細胞向心肌樣細胞分化的實驗研究.pdf

1、研究背景
　　近年來冠心病(CoronaryHeartDisease,CHD)發(fā)病率逐年增加，特別是心肌梗死(MyocaridalInfarction,MI)等導致的缺血性心肌病(IschemicCardiomyopathy,ICM)已成為影響人類健康的主要疾病之一。最近研究表明心肌梗死后也有少量的心肌細胞發(fā)生分裂增殖，但是分裂增殖的細胞數量偏少，每年1％更新率不足以彌補心肌梗死時大量心肌細胞的壞死。因此心肌梗死引起的大量心肌細胞

2、壞死最終導致缺血性心肌病的發(fā)生，引發(fā)嚴重心力衰竭和各種心血管并發(fā)癥，五年死亡率高達45％左右。盡管冠心病的藥物治療、外科搭橋技術和介入治療技術不斷提高，但是死亡率仍居高不下。因此心肌梗死后，如何修復壞死心肌細胞一直是科研人員和臨床醫(yī)師面臨的嚴峻挑戰(zhàn)。近年來干細胞移植治療為缺血性心肌病患者帶來新的曙光，目前骨髓間充質干細胞(BoneMarrowMesenchymalStemCells,BMMSCs)移植治療心肌梗死的研究已取得令人鼓舞的進

3、展，但如何誘導BMMSCs獲得足夠數量的心肌樣細胞成為研究的難點和熱點之一。隨著研究的深入，在不久的將來將逐步解決在心肌梗死后缺血性心肌病的BMMSCs移植治療過程中出現的各種問題，并獲得顯著療效。
　　研究目的
　　1.探討大鼠BMMSCs體外分離、純化、傳代及鑒定方法。
　　2.觀察PFT-α對大鼠BMMSCs增殖和凋亡的影響及可能機制。
　　3.探索PFT-α對大鼠BMMSCs向心肌樣細胞誘導分化的影響路徑

4、及其可能機制。
　　研究方法
　　1.大鼠BMMSCs體外分離、純化及鑒定：采用頸椎脫臼法處死大鼠后分離下肢長骨，將獲取的骨髓細胞通過密度梯度離心法聯合差速貼壁法去除BMMSCs中混雜的其他細胞，獲得純化的BMMSCs。倒置相差顯微鏡下觀察BMMSCs在培養(yǎng)傳代過程中細胞形態(tài)學變化，聯合流式細胞儀檢測BMMSCs陽性表面標記抗原CD44和陰性標記抗原CD45進行細胞鑒定。
　　2.PFT-α對大鼠BMMSCs增殖和凋亡

5、的影響：取第4代BMMSCs，采用MTT法檢測PFT-α的細胞毒性。同時進行分組處理：空白對照組(CON)、5-AZA組(10μmol/L)、PFT-α組(20μmol/L)、5-AZA+PFT-α組(10μmol/L+20μmol/L)。MTT法檢測PFT-α對BMMSCs增殖的影響，流式細胞儀檢測PFT-α對BMMSCs凋亡的影響，WesternBlotting法檢測P53、P21蛋白的表達。
　　3.PFT-α誘導BMMSC

6、s分化為心肌樣細胞：取第4代BMMSCs進行分組誘導，空白對照組(CON)、5-AZA組(10μmol/L)、PFT-α組(20μmol/L)、5-AZA+PFT-α組(10μmol/L+20μmol/L)。各組誘導24h后更換常規(guī)培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)4w。顯微鏡下觀察不同時間點細胞形態(tài)學變化，免疫熒光染色法鑒定各組BMMSCs誘導后1w、4w時心肌肌鈣蛋白I(cTnI)和鏈接蛋白-43(CX-43)的表達；WesternBlotting法檢

7、測cTnI、P53、P21蛋白的表達；流式細胞儀檢測心肌樣細胞分化率。
　　研究結果
　　1.大鼠BMMSCs體外培養(yǎng)形態(tài)特征及鑒定：原代BMMSCs體積較小，形態(tài)多樣，大部分細胞為橢圓形、短梭形，7d后細胞體積增大，以長梭形為主，形成細胞集落。傳代后細胞呈長梭形、旋渦狀生長，且排列緊密、形態(tài)均一、趨向一致。流式細胞儀檢測BMMSCs表面標志抗原CD44和CD45，結果顯示：CD44陽性表達率為(89.98±1.29)％，C

8、D45陽性表達率為(2.14±0.22)％。
　　2.PFT-α對大鼠BMMSCs增殖和凋亡的影響：MTT法檢測不同濃度PFT-α的細胞毒性，結果顯示：當PFT-α濃度等于或者低于20μmol/L時，對BMMSCs的增殖有一定促進作用，而當其濃度達到40μmol/L時，PFT-α則可明顯抑制BMMSCs的增殖，當濃度達到80μmol/L時，PFT-α顯著抑制BMMSCs細胞的增殖；MTT法檢測PFT-α對BMMSCs增殖的影響，結

9、果顯示：BMMSCs在處理后前3d，各組細胞增殖沒有明顯差異，在第5d時，5-AZA組對BMMSCs增殖表現出明顯抑制，與CON組、PFT-α組及5-AZA+PFT-α組比較有顯著統(tǒng)計學差異(P＜0.01)，在第7d時，也同樣表現出這樣的差異(P＜0.01)，并且PFT-α組和5-AZA+PFT-α組BMMSCs增殖明顯優(yōu)于空白對照組(P＜0.01)；流式細胞儀檢測各組BMMSCs凋亡率，結果顯示：5-AZA組細胞凋亡率最高，與CON組

10、、PFT-α組及5-AZA+PFT-α組比較有顯著統(tǒng)計學差異(P＜0.01)，其余3組無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)；Westernblotting法測定P53、P21蛋白表達，結果顯示：5-AZA組表達量明顯強于其余3組，與CON組、PFT-α組、5-AZA+PFT-α組比較有顯著統(tǒng)計學差異(P＜0.001)；而PFT-α組P53、P21蛋白表達量明顯減少，與CON組和5-AZA+PFT-α組比較有統(tǒng)計學差異(P＜0.01)，CON組和

11、5-AZA+PFT-α組比較無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　3.PFT-α誘導BMMSCs分化為心肌樣細胞的鑒定：各組BMMSCs誘導后細胞形態(tài)學變化：除CON組外，各組細胞誘導約2w后，開始出現細胞體積及核增大，大部分細胞變?yōu)殚L梭狀。誘導4w時鄰近細胞間連接較前緊密，并形成肌節(jié)樣結構；免疫熒光染色鑒定結果：誘導后1w時CON組未見cTnI和CX-43免疫熒光表達，其余3組均可見少量表達。誘導后4w時可見CON組少量表達cTn

12、I和CX-43，其余3組均強表達cTnI和CX-43，并可見肌管樣結構；WesternBlotting檢測cTnI的表達，1w時CON組未見表達cTnI，其余3組均有少量表達。4w時，CON組可見少量表達，其余3組均有強表達。各組cTnI表達在4w時均明顯高于1w時的表達；流式細胞儀檢測心肌樣細胞的分化率，結果顯示：CON組分化率為(2.34±0.91)％，5-AZA組為(21.47±5.41)％，PFT-α組為(29.85±1.96)

13、％，5-AZA+PFT-α組為(30.97±5.74)％，5-AZA組、PFT-α組和5-AZA+PFT-α組與CON組比較均有顯著統(tǒng)計學差異(P＜0.01)，PFT-α組、5-AZA+PFT-α組與5-AZA組比較均有顯著統(tǒng)計學差異(P＜0.01)，PFT-α組和5-AZA+PFT-α組無明顯統(tǒng)計學差異(P＞0.05)；WesternBlotting檢測P53、P21蛋白表達，結果顯示：誘導1w時，5-AZA組P53、P21表達最強，

14、PFT-α組幾乎不表達，5-AZA組與其余3組比較均有顯著統(tǒng)計學差異(P＜0.01)，PFT-α和5-AZA+PFT-α組間無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。誘導4w時，5-AZA組仍強表達，其余3組表達較1w時有所增強，5-AZA組、PFT-α組、混合組與CON組比較均有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，5-AZA組與PFT-α組比較有顯著統(tǒng)計學差異(P＜0.01)。PFT-α組、混合組組內誘導4w時P53、P21表達量與1w時比較均有統(tǒng)計學差

15、異(P＜0.05)。
　　研究結論
　　1.采用密度梯度離心法聯合差速貼壁法能夠獲得純化的BMMSCs，通過觀察BMMSCs形態(tài)學特征和檢測BMMSCs陽性標記抗原CD44和陰性標記抗原CD45，可以鑒定純化的BMMSCs。
　　2.PFT-α可以促進BMMSCs的增殖，抑制BMMSCs的凋亡。當PFT-α濃度≤20μmol/L時，對BMMSCs無毒性作用，能夠促進BMMSCs增殖，抑制BMMSCs凋亡。當濃度＞20μ