己烯雌酚對(duì)小鼠睪丸引帶組織中胰島素樣因子3受體LGR8的影響.pdf

1、目的:
　　近年來(lái)許多研究表明環(huán)境雌激素(EEs)可以造成男性生殖系統(tǒng)分化和發(fā)育異常,且大多數(shù)與睪丸發(fā)育、下降不全相關(guān),而睪丸引帶與睪丸發(fā)育、下降關(guān)系密切。在胚胎發(fā)育過(guò)程中,睪丸由高位腹腔下降到陰囊分為兩個(gè)階段,經(jīng)腹下降階段和腹股溝陰囊階段。睪丸經(jīng)腹下降階段主要由INSL3控制。敲除INSL3或它的受體LGR8基因都會(huì)使小鼠發(fā)生隱睪。EEs是否通過(guò)影響INSL3的受體LGR8干擾INSL3-LGR8的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)尚不清楚。本研究利用經(jīng)

2、典的EEs己烯雌酚(DES)直接作用于孕期昆明小鼠,通過(guò)觀察胎鼠和幼鼠睪丸引帶的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化,并檢測(cè)LGR8蛋白和mRNA的表達(dá),來(lái)探討外源性雌激素(EEs)影響睪丸引帶發(fā)育的可能途徑。
　　材料和方法:
　　SPF級(jí)8～10周齡雌性昆明小鼠120只隨機(jī)分成6組(每組20只):正常組、對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組2、實(shí)驗(yàn)組3、實(shí)驗(yàn)組4。實(shí)驗(yàn)組1-4分別給予DES0.1、1.0、10.0、及100.0μg.kg-1.d-1。DES

3、以二甲基亞砜(DMSO)和生理鹽水為溶劑。對(duì)照組僅給予DMSO和生理鹽水;正常組不給任何藥物。雌雄小鼠按常規(guī)合籠交配,以出現(xiàn)陰栓作為受孕標(biāo)志。發(fā)現(xiàn)陰栓當(dāng)天定為胎齡第0天,記為E0(Embryonicday)。在E9～E17上午8～9時(shí)皮下注射給藥,每組所用的DES均溶于等量的DMSO及生理鹽水中,以保證每次每只小鼠每千克體重所給予的DMSO和生理鹽水相同。E18脫頸椎處死孕鼠,迅速取出胎鼠,切取其下腹部經(jīng)10％福爾馬林固定24小時(shí),然后

4、給予水洗、梯度酒精脫水、二甲苯透明,石蠟包埋。幼鼠組待其自然分娩,小鼠出生第1天記為PND0(Postnatalday)。于PND20處死雄性小鼠,解剖獲得睪丸引帶,予固定、石蠟包埋。對(duì)包埋組織塊作4μm厚冠狀位連續(xù)切片并進(jìn)行常規(guī)HE染色和特殊的免疫組織化學(xué)研究,觀察睪丸引帶結(jié)構(gòu)的變化,檢測(cè)各組睪丸引帶組織中胰島素樣因子3受體(LGR8)的表達(dá)。應(yīng)用3倍手術(shù)放大鏡和顯微器械解剖獲得E18胎鼠睪丸引帶,肉眼解剖獲得PND20小鼠睪丸引帶。

5、用TRIzol法提取引帶組織總RNA,瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度法鑒定RNA完整性及純度。DNase處理RNA樣本,然后逆轉(zhuǎn)錄法合成第一鏈cDNA。行PCR法鑒定睪丸引帶中存在LGR8的表達(dá)。PCR產(chǎn)物測(cè)序,并取一定量行瓊脂糖凝膠電泳,利用凝膠分析系統(tǒng)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物條帶進(jìn)行掃描,將凝膠電泳圖像輸入凝膠電泳圖像分析軟件(BandScan5.0)進(jìn)行表達(dá)強(qiáng)度分析。TRIzol法提取總RNA的同時(shí)提取總蛋白,WesternBlot檢測(cè)各組睪丸引

6、帶LGR8蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.解剖可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組胎鼠睪丸在腹腔的位置明顯較正常組高,實(shí)驗(yàn)組幼鼠隱睪發(fā)生率高。光鏡觀察可見(jiàn)胎鼠正常組、對(duì)照組睪丸引帶發(fā)育良好,中間的間葉組織和外周的肌源細(xì)胞之間分界清楚;實(shí)驗(yàn)組尤其是高劑量組可見(jiàn)睪丸引帶發(fā)育不良,間葉組織和肌源細(xì)胞之間無(wú)明顯分界,組織結(jié)構(gòu)紊亂。幼鼠睪丸引帶可見(jiàn)肌源細(xì)胞呈纖維狀,間葉組織未見(jiàn)明顯細(xì)胞結(jié)構(gòu)。正常組和實(shí)驗(yàn)組未見(jiàn)明顯不同。
　　2.免疫組織化學(xué)染色可見(jiàn)LGR

7、8陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色或棕褐色,表達(dá)于睪丸引帶細(xì)胞膜,正常組、對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組均有表達(dá),相同發(fā)育階段的正常組和對(duì)照組陽(yáng)性表達(dá)較強(qiáng),實(shí)驗(yàn)組陽(yáng)性表達(dá)較弱,且隨DES劑量的增加陽(yáng)性表達(dá)減弱。胎鼠(E18)各實(shí)驗(yàn)組與正常組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),幼鼠(PND20)DES1μg、10μg、100μg組與正常組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。同劑量組幼鼠(PND20)比胎鼠(E18)LGR8陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)(P<0.05)。
　　3.正常組、

8、對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠睪丸引帶中均存在LGR8mRNA的表達(dá)。相同發(fā)育階段的正常組和對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,DES高劑量(10μg、100μg)組與正常組和對(duì)照組相比LGR8mRNA表達(dá)增加(P<0.05)。各相同劑量組的胎鼠LGR8mRNA與幼鼠相比未見(jiàn)差別(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)組PCR產(chǎn)物測(cè)序未見(jiàn)明顯突變。
　　4.WesternBlot沒(méi)有檢測(cè)到LGR8特異性蛋白表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　1.孕期DES暴露可導(dǎo)致子代小鼠睪

9、丸引帶形態(tài)異常、組織結(jié)構(gòu)紊亂,且與劑量關(guān)系密切。
　　2.LGR8表達(dá)于不同發(fā)育階段的睪丸引帶組織,亞細(xì)胞定位于細(xì)胞膜。孕期DES暴露可使子代小鼠睪丸引帶組織中LGR8蛋白表達(dá)水平降低,相同劑量的DES對(duì)胎鼠LGR8蛋白表達(dá)的抑制更明顯。隨著子代小鼠的生長(zhǎng)發(fā)育,LGR8蛋白表達(dá)有一定的增加。
　　3.DES可上調(diào)睪丸引帶組織中LGR8mRNA的表達(dá),但未發(fā)現(xiàn)基因突變。
　　4.DES對(duì)睪丸引帶組織LGR8蛋白和mRNA