骨肉瘤干細胞自我更新的調(diào)控機制及意義.pdf

1、文重點探索了TSSC3基因、Notch通路及血管內(nèi)皮細胞對OSC自我更新能力的影響和機制。本文采用體外基因過表達和敲低技術(shù)、PCR、Western-blot、皮下移植瘤和顱內(nèi)移植瘤模型、臨床病理資料分析、免疫組化、免疫熒光、流式細胞術(shù)、Transwell雙室共培養(yǎng)等實驗技術(shù)方法，分別在第一部分研究了印跡基因TSSC3、Nanog在維持OSC干性表型中的作用，并在第二部分初步篩選了Notch通路眾多相關(guān)分子中有可能影響OSC的配體和受體，

2、以及在內(nèi)皮細胞微環(huán)境中的作用。主要的實驗內(nèi)容及實驗結(jié)果和結(jié)論如下：
　　一、TSSC3可通過Src/Akt抑制Nanog表達并抑制OSC干性表型
　　1.TSSC3可以抑制OSC干性表型
　　通過免疫組化方法、RT-PCR、Western-blot方法、成球培養(yǎng)方法、流式細胞術(shù)等實驗方法得到以下結(jié)果:
　　1.1高表達TSSC3的患者預(yù)后在總生存期(OS)和無病生存期(PFS)都遠好于低表達TSSC3的患者(P＜

3、0.05);TSSC3基因具有提示腫瘤復(fù)發(fā)潛能的作用，在復(fù)發(fā)VS未復(fù)發(fā)的病人中陽性比例是1/15 VS9/26，P＜0.05。
　　1.2利用成球培養(yǎng)的方法富集不同骨肉瘤細胞株(MTH、SaoS2)的OSC，干性相關(guān)核蛋白(Nanog、Sox2、Oct4)表達的升高;且在OSC中TSSC3表達明顯降低。
　　1.3通過在不同骨肉瘤細胞系中建立TSSC3過表達模型，檢測到過表達TSSC3后Nanog的表達顯著降低，同時骨肉瘤細

4、胞系的體外成球能力和成球體積都有明顯下降（MTH細胞在5個/孔濃度下平均每個細胞能產(chǎn)生0.44±0.09個細胞球VS0.23±0.02個，P＜0.05;SaOS2細胞在5個/孔濃度下平均每個細胞能產(chǎn)生0.42±0.18個細胞球VS0.34±0.07個，P＜0.05），干性表面標(biāo)記CD133、CD117、Stro1表達也明顯下降(P＜0.05)。
　　2.過表達Nanog可以增強OSC干性表型
　　通過免疫組化方法、成球培養(yǎng)方

5、法、流式細胞術(shù)、裸鼠成瘤能力實驗、劃痕實驗和Transwell侵襲實驗、化療抵抗實驗等方法得到以下結(jié)果:
　　2.1高表達Nanog和發(fā)生轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者有強相關(guān)性，在發(fā)生轉(zhuǎn)移VS未發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者中Nanog的陽性表達比例為7/12 VS9/29，P＜0.05;高表達Nanog的患者的總生存期和無病生存期均明顯延長(P＜0.05)。
　　2.2在過表達TSSC3的細胞模型上再次過表達了Nanog，檢測到過表達Nanog后其體

6、外成球能力和成球體積都有顯著增強。（MTH細胞在5個/孔濃度下平均每個細胞能產(chǎn)生0.45±0.05個細胞球VS0.83±0.12個，P＜0.05; SaOS2細胞在5個/孔濃度下平均每個細胞能產(chǎn)生0.35±0.13個細胞球VS0.78±0.23個，P＜0.05）。過表達TSSC3的骨肉瘤細胞系的裸鼠成瘤能力明顯降低，再次過表達Nanog后其成瘤能力再次增強，MTH細胞成瘤數(shù)在每個注射點10000個細胞時為3/5 VS2/5 VS5/5，

7、每個注射點1000個細胞時為2/5 VS1/5 VS5/5; SaOS2細胞成瘤數(shù)在每個注射點40000個細胞時為4/5 VS4/5 VS5/5，每個注射點4000個細胞時為3/5 VS1/5 VS4/5。
　　2.3過表達Nanog的骨肉瘤細胞系的侵襲、遷移能力明顯增強(P＜0.05)，并且在順鉑的化療抵抗實驗中其化療抵抗能力增強，通過劑量依賴曲線發(fā)現(xiàn)過表達Nanog后順鉑的IC50值也有很明顯升高。
　　3.敲低Nano

8、g的骨肉瘤細胞系的干性表型明顯下降。
　　通過成球培養(yǎng)方法、裸鼠成瘤能力實驗、劃痕實驗和Transwell侵襲實驗、化療抵抗實驗等方法得到以下結(jié)果:
　　3.1極限稀釋法發(fā)現(xiàn)敲低Nanog后的骨肉瘤細胞系其體外成球能力和成球體積都有顯著降低（MTH細胞敲低Nanog后在5個/孔濃度下平均每個細胞能產(chǎn)生細胞球數(shù)為0.83±0.28 VS0.28±0.22和0.68±0.21個，P＜0.05; SaOS2細胞敲低Nanog后在5

9、個/孔濃度下平均每個細胞能產(chǎn)生細胞球數(shù)為0.78±0.24 VS0.52±0.23，0.37±0.25個，P＜0.05）。敲低Nanog后的MTH細胞成瘤數(shù)在每個注射點40000個細胞時為5/5 VS3/5，每個注射點4000個細胞時為4/5 VS2/5; SaOS2細胞成瘤數(shù)在每個注射點40000個細胞時為5/5 VS4/5，每個注射點4000個細胞時為4/5 VS2/5。
　　3.2劃痕實驗和Transwell侵襲實驗發(fā)現(xiàn)敲低

10、Nanog的骨肉瘤細胞系的侵襲、遷移能力明顯減弱(P＜0.05)。在順鉑的化療抵抗實驗中其化療抵抗能力也有減弱，通過劑量依賴曲線發(fā)現(xiàn)敲低Nanog后順鉑的IC50值也有很明顯下降。
　　4.Src介導(dǎo)了TSSC3敲低Nanog的作用
　　通過成球培養(yǎng)方法、PT-PCR、Western-blot、藥物抑制實驗、siRNA轉(zhuǎn)染實驗、流式細胞術(shù)等方法得到以下結(jié)果:
　　4.1在過表達TSSC3的細胞系中檢測了p-Src和p-

11、Akt的表達，發(fā)現(xiàn)伴隨著TSSC3的上調(diào)，p-Src和p-Akt的表達發(fā)生了下調(diào)。利用Src抑制劑PP2抑制Src通路活性，檢測到Nanog的表達下降(P＜0.05）。
　　4.2利用Src siRNA和Lv-TSSC3進行同時處理，檢測Nanog的基因表達情況，發(fā)現(xiàn)敲低Src后可以抑制Nanog表達(P＜0.05），在此基礎(chǔ)上過表達TSSC3無法進一步抑制Nanog表達（P＞0.05）。敲低Src后可以抑制骨肉瘤細胞的體外成球數(shù)

12、量和成球體積以及干性表面標(biāo)記的表達(P＜0.05)，在此基礎(chǔ)上過表達TSSC3后無法進一步抑制體外成球能力和干性表面標(biāo)記的表達。
　　5.Akt通路介導(dǎo)了TSSC3敲低Nanog的作用
　　通過成球培養(yǎng)方法、PT-PCR、Western-blot、藥物抑制與刺激實驗、流式細胞術(shù)等方法得到以下結(jié)果:
　　5.1p-Src和p-Akt的表達在干細胞中的表達相對于對應(yīng)的單層貼壁細胞中都明顯增強(P＜0.05)。利用Akt抑制

13、劑LY294002對細胞進行持續(xù)培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)抑制Akt磷酸化活性可以抑制Nanog表達(P＜0.05)。
　　5.2利用Akt通路激活劑IGF1和Lv-TSSC3進行同時處理，發(fā)現(xiàn)Akt激活后可以明顯增強Nanog表達，而過表達TSSC3后再激活A(yù)kt通路可以回復(fù)Nanog的表達。在IGF1和Lv-TSSC3同時分組處理時，Akt激活后可以明顯增強體外成球數(shù)量和成球體積以及干性表面標(biāo)記的表達，而過表達TSSC3后再激活A(yù)kt通路可

14、以回復(fù)體外成球能力和干性表面標(biāo)記表達。
　　6.各分子表達與骨肉瘤病人臨床病理參數(shù)和預(yù)后的關(guān)系
　　通過免疫組化方法和統(tǒng)計學(xué)分析，實驗得到了以下結(jié)果:p-Src高表達與骨肉瘤病人總生存期和無病生存期較短有極強的聯(lián)系(P＜0.05)，而p-Akt表達與骨肉瘤病人預(yù)后沒有明顯聯(lián)系，P＞0.05。在臨床標(biāo)本上p-Src表達與p-Akt表達有明顯正相關(guān)(P＜0.05)，p-Src表達與Nanog表達有明顯正相關(guān)(P＜0.05)。p-

15、Src表達量與病人轉(zhuǎn)移率正相關(guān)（發(fā)生轉(zhuǎn)移VS未發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者的p-Src陽性比例為7/12 VS8/29，P＜0.05），也與截肢手術(shù)采用率正相關(guān)（采用截肢手術(shù)VS采用局部切除手術(shù)的患者p-Src陽性比例為11/20 VS4/21，P＜0.05），而Akt通路與以上參數(shù)沒有明顯聯(lián)系。
　　二、Notch通路和內(nèi)皮細胞在維持OSC干性中發(fā)揮作用。
　　1.通過成球培養(yǎng)法建立了U2OS的細胞球模型
　　通過RT-PCR和W

16、estern-blot實驗檢測到U2OS細胞球中的干性轉(zhuǎn)錄因子Oct4、Nanog的表達相比相應(yīng)的貼壁細胞都有明顯增高(P＜0.05)，而Sox2在U2OS中表達量較低，沒有明確趨勢。
　　2.Hes1是Notch通路在OSC中起作用的效應(yīng)分子
　　通過RT-PCR和Western-blot實驗，發(fā)現(xiàn)Notch通路的兩個重要下游效應(yīng)分子Hes1、Hey1的表達，在三種細胞系的細胞球中都有明顯上調(diào)(P＜0.05);但是Hey1

17、在蛋白水平并不能很明確的檢測到。
　　3.DLL4是Notch通路在OSC中起作用的配體之一
　　RT-PCR和Western-blot實驗檢測了Notch通路的眾多配體在干細胞和貼壁細胞中的表達差異，發(fā)現(xiàn)其中DLL4的表達上調(diào)最為明顯(P＜0.05)，并且在三種干細胞球中都表現(xiàn)一致。
　　4.Notch3是Notch通路在OSC中起作用的受體之一
　　RT-PCR、Western-blot和免疫熒光實驗分析了四