免疫突觸的形成對類風濕關節(jié)炎中巨噬細胞凋亡率影響的研究.pdf

1、類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種以多關節(jié)慢性滑膜炎、關節(jié)損傷和骨破壞為特征的系統(tǒng)性自身免疫性疾病，同時，亦是一種慢性炎癥性機能紊亂，主要包括滑膜襯里層增生肥大導致的巨噬樣滑膜細胞和成纖維樣滑膜細胞侵襲性增強、大量血管新生及單核細胞浸潤。已有大量證據(jù)證明在RA滑液和增生的滑膜中存在著大量的巨噬細胞，巨噬細胞不僅能產(chǎn)生大量的前炎性因子，又可產(chǎn)生大量的趨化因子，從而與RA的發(fā)病機制密切相關，并最終導致炎癥加

2、劇和關節(jié)破壞。此外，在RA體內(nèi)，巨噬細胞可作為抗原提呈細胞與T淋巴細胞相互結合，產(chǎn)生促進T細胞活化的超分子結構-免疫突觸（Immunological synapse,IS），活化其體內(nèi)T淋巴細胞的同時也將自我活化，活化后的巨噬細胞分泌大量的IL-1、TNF-α、IL-6等細胞因子促進RA的病情進展，當大量的巨噬細胞和T細胞過度活化、過量增殖時則可能導致巨噬細胞活化綜合癥（macrophage activation syndrome,MA

3、S），從而危及患者生命。因此，將巨噬細胞作為治療RA的主要治療靶點，探索抑制巨噬細胞活化、促進其凋亡的途徑將對RA的治療起到導向性的作用。有研究報道，人體內(nèi)IS的形成能抑制參與其形成的抗原提呈細胞-DC細胞的凋亡率，那么，在RA患者體內(nèi)大量存在的巨噬細胞作為抗原提呈細胞參與IS的形成后，是否會降低其在RA體內(nèi)的凋亡率，使其生存時間延長？國內(nèi)外無相關報道。同時，有研究證明臨床常用于治療RA的免疫抑制劑環(huán)孢素A(Cyclosporin A,

4、CsA)有抑制單核細胞株THP-1參與的IS形成的作用，而CsA對巨噬細胞參與的IS的形成是否同樣有抑制作用？同時，在RA體內(nèi)呈顯著高表達的CsA的配體親環(huán)素A（Cyclophilin A,CypA）對IS的形成及功能是否有影響？國內(nèi)外也無相關報道，故本實驗設計以下實驗內(nèi)容：
　　【目的】
　　本課題旨在研究：
　　1、觀察由THP-1單核細胞株誘導分化的巨噬細胞與JurkatT細胞共培養(yǎng)形成IS后巨噬細胞的凋亡率較單

5、獨培養(yǎng)的巨噬細胞的凋亡率的變化情況。
　　2、探討在RA患者體內(nèi)大量存在，且其數(shù)量及活化程度與RA患者的病情嚴重程度存在一致性的巨噬細胞參與IS的形成后，對其自身凋亡的影響。
　　3、研究在RA患者體內(nèi)呈高表達的CypA對IS調(diào)控的巨噬細胞凋亡的影響作用。
　　4、進一步探討與CypA為配受體關系且臨床常用于治療RA的免疫抑制劑CsA對IS調(diào)控的巨噬細胞凋亡的影響作用。
　　【方法】
　　大致分為二部分：<

6、br>　　1、將單核細胞株THP-1經(jīng)PMA刺激誘導分化為巨噬細胞，并用葡萄球菌腸毒素(SEB)(100ng/ml）包被后與活化的JurkatT細胞共培養(yǎng)促IS形成，之后將共培養(yǎng)體系置于無血清RPMI-1640培養(yǎng)基中誘導凋亡，16小時之后以AnnexinV-PI染色，流式細胞術檢測巨噬細胞的凋亡情況、TUNEL凋亡檢測法觀察巨噬細胞的凋亡情況。整個實驗過程中以單獨無血清RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)的巨噬細胞作為對照。同時，觀察加或不加

7、CypA（200ng/ml）、CsA(1ug/ml)對IS調(diào)控的巨噬細胞凋亡的影響。
　　2、臨床收集10例健康對照及10例活動期確診RA患者外周血，采用免疫磁珠法分離CD4+T細胞后置于抗CD3抗體包被的24孔板中誘導活化24小時，之后將其與誘導分化后的巨噬細胞進行共培養(yǎng)促IS形成，同時設加或不加CypA（200ng/ml）、CsA(1ug/ml)組。之后將共培養(yǎng)體系移入無血清RPMI-1640培養(yǎng)基中誘導凋亡16小時后Anne

8、xinV-PI染色，流式細胞術檢測巨噬細胞的凋亡情況、TUNEL凋亡檢測法觀察巨噬細胞的凋亡情況。數(shù)據(jù)采用兩樣本t檢驗進行分析。
　　【結果】
　　1、流式細胞術AnnexinV-PI法檢測THP-1來源巨噬細胞的凋亡率結果顯示：單獨培養(yǎng)的巨噬細胞的凋亡率為(61.4±2.4)％，參與IS的形成后巨噬細胞的凋亡率下降至(32.9±2.8)％(P<0.05)，在突觸形成過程中加入CypA(200ng/ml)則進一步降低巨噬細胞

9、的凋亡率至(27.2±2.1)％(P<0.05)。而在突觸形成的過程中加入CsA(1ug/ml)使巨噬細胞的凋亡率由突觸形成時的(32.9±2.8)％回升至(48.8±2.0)％(P<0.05)。
　　2、流式細胞術AnnexinV-PI法檢測RA及健康對照巨噬細胞的凋亡率結果顯示：RA患者外周血單核細胞誘導分化的巨噬細胞在無血清RPMI-1640中培養(yǎng)16h后其凋亡率為(24.1±9.7)％，明顯低于由正常對照外周血單核細胞誘導

10、的巨噬細胞的凋亡率(37.1±12.5)％(P<0.05)，當參與形成IS后該種巨噬細胞的凋亡率由(24.1±9.7)％下降至(15.2±5.5)％(P<0.001)。在突觸形成的過程中加入CypA則進一步降低巨噬細胞的凋亡率至(13.7±3.9)％(P<0.05)。而在突觸形成的過程中加入CsA(1ug/ml)使巨噬細胞的凋亡率由參與突觸形成時的(15.2±5.5)％回升至(19.3±6.1)％(P<0.01)。在健康對照，IS的形成

11、對巨噬細胞凋亡的保護作用有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但在突觸形成的過程中加入CsA、CypA對巨噬細胞的凋亡率的影響均無明顯統(tǒng)計學差異。
　　3、TUNEL凋亡檢測結果顯示：RA患者中單獨培養(yǎng)的巨噬細胞TUNEL標記陽性細胞百分率為(26.5±4.4)％，參與IS形成后TUNEL標記陽性細胞百分率降至(19.0±5.1)％（P<0.01）。在突觸形成的過程中加入CypA后，巨噬細胞TUNEL標記陽性細胞百分率進一步降至(18.2

12、±2.6)％（P<0.05），但在突觸形成的過程中加入CsA則使巨噬細胞的TUNEL標記陽性細胞百分率回升至(30.8±4.3)％（P<0.05）。在健康對照單獨培養(yǎng)的巨噬細胞TUNEL標記陽性細胞百分率為(35.0±7.3)％，較RA患者單獨培養(yǎng)的巨噬細胞TUNEL標記陽性細胞百分率（26.5±4.4)％有明顯升高（P<0.05），同時，健康對照及細胞株組中，參與IS形成的巨噬細胞TUNEL標記陽性細胞百分率較單獨培養(yǎng)的巨噬細胞的標記

13、陽性細胞百分率有所降低，差異有統(tǒng)計學意義，其余健康對照組及細胞株各組間比較均無統(tǒng)計學差異。
　　【結論】
　　1、經(jīng)超抗原SEB包被的THP-1細胞株來源的巨噬細胞與活化的JurkatT細胞形成IS后，巨噬細胞的凋亡率顯著減少，即表明IS的形成可抑制參與其形成的巨噬細胞的凋亡率。
　　2、RA患者來源的T細胞和巨噬細胞之間IS的形成可顯著的抑制巨噬細胞的凋亡率，即促使巨噬細胞凋亡減少、生存時間延長。
　　3、在R