重組四價Aβ-,1-15-腺病毒疫苗的構(gòu)建及對Tg2576鼠的免疫治療研究.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一種以進(jìn)行性的記憶喪失、意識障礙及人格變化為臨床特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，也是最常見的一種老年癡呆。因此，以Aβ為靶的免疫治療方法成為AD研究的熱點。 1999年Schenk等人首次用Aβ42全肽疫苗免疫接種AD轉(zhuǎn)基因小鼠(PDAPP)試圖以免疫的方法來治療AD。研究結(jié)果表明，疫苗接種不僅可以清除PDAPP小鼠腦內(nèi)已經(jīng)形成的老年斑，而且還可以明顯改善APP+PS1

2、和TgCRND8轉(zhuǎn)基因小鼠的認(rèn)知功能。本室在前期的研究中成功制備了Aβ42肽疫苗及MAPs-Aβ1-15肽疫苗，并在SD大鼠、BALB/C小鼠、Tg2576小鼠及恒河猴體內(nèi)試驗發(fā)現(xiàn)其具有良好的免疫原性。雖然如此，但仍有許多不盡人意的地方：1)研究者們制備的抗原大多為化學(xué)合成，合成肽的化學(xué)修飾難度大，成本高，而且純度不高。2)研究者們在制備含有AβN末端B細(xì)胞抗原表位的多價疫苗時，大多是將B細(xì)胞抗原表位片段直接與一個新的T細(xì)胞表位連接，或

3、者B細(xì)胞抗原表位直接串聯(lián)，容易影響抗原的空間結(jié)構(gòu)，不利于Aβ的B細(xì)胞抗原表位的暴露。3)很少對免疫原引起的T細(xì)胞反應(yīng)進(jìn)行研究。鑒于以上因素，在本室前期制備的Aβ1-15 DNA疫苗的基礎(chǔ)上，本課題擬制備以柔性肽串聯(lián)4個Aβ1-15為免疫原、以粒．巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte/macrophage-colony stimulating factor，GM-CSF)為基因佐劑、以腺病毒為載體的共表達(dá)基因疫苗Ad-4×Aβ15

4、，同時以共表達(dá)Aβ42及GM-CSF的腺病毒疫苗Ad-Aβ42和僅表達(dá)GM-CSF的腺病毒疫苗Ad-GMCSF為對照。免疫接種野生型C57BL/6鼠及Tg2576 AD轉(zhuǎn)基因小鼠，觀察其體液和細(xì)胞免疫治療效應(yīng)，探討重組四價Aβ1-15腺病毒AD疫苗應(yīng)用于防治AD的潛在可能性，為重組四價Aβ1-15腺病毒疫苗的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。 材料和方法： 1 Ad-4×Aβ15疫苗的制備以本室保存的含有小鼠IgG κ(輕鏈信號肽序

5、列和甘氨酸-絲氨酸串聯(lián)4個Aβ1-15的重組質(zhì)粒pcDNA3.1-s4×Aβ15為模板酶切出帶有信號肽的4×Aβ15、RT-PCR法從conA刺激培養(yǎng)的小鼠脾臟細(xì)胞中擴增的小鼠GM-CSF基因以及從Clontech公司載體pIRES2-EGFP中擴增的IRES基因，三者依次亞克隆入pAdTrack-CMV質(zhì)粒中產(chǎn)生pAdTrack-4×Aβ15-IRES-GMCSF重組穿梭載體。利用pAdEasy系統(tǒng)，當(dāng)pAdTrack-4×Aβ15-

6、IRES-GMCSF穿梭載體在大腸桿菌BJ5183中與腺病毒骨架載體pAdEasy-1發(fā)生同源重組后，提取陽性重組子。 2 Ad-4×Aβ15疫苗接種C57BL/6鼠的體液免疫效應(yīng)觀察為了確證重組腺病毒疫苗能否誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性的抗Aβ42抗體反應(yīng)，Ad-4×Aβ15、Ad-Aβ42及Ad-GMCSF三種病毒通過鼻黏膜接種6～8周野生型C57BL/6小鼠，每3周一次，每次用量1×108 PFU，一共持續(xù)接種3個月，接種前、接種后

7、6周和12周通過尾靜脈取血約150 μL。間接ELISA法檢測小鼠血清中抗Aβ42抗體的水平；Western blot方法檢測血清抗Aβ42抗體的特異性。 3 Ad-4×Aβ15疫苗接種Tg2576鼠的體液免疫及細(xì)胞免疫效應(yīng)觀察Ad-4×Aβ15、Ad-Aβ42及Ad-GMCSF三種病毒通過鼻黏膜接種12月齡Tg2576轉(zhuǎn)基因鼠，每3周一次，每次用量1×108PFU，一共持續(xù)接種7個月，每次接種后兩周通過尾靜脈取血約150 μL

8、。間接ELISA法檢測小鼠血清中抗Aβ42抗體的水平；ELISA橋聯(lián)法檢測血清抗Aβ42 IgG亞類。 最后一次免疫后2周，心臟采血，分離脾臟細(xì)胞，分別用重組表達(dá)的4×Aβ15和化學(xué)合成的Aβ40肽刺激培養(yǎng)的脾臟細(xì)胞。3H-TDR法測定4×Aβ15和Aβ40肽刺激對淋巴細(xì)胞的增殖作用；ELISA雙抗體夾心法檢測4×Aβ15和Aβ40肽刺激后培養(yǎng)液中IFN-γ和IL-4的水平；ELISPOT法測定4×Aβ15和Aβ40肽刺激后分泌

9、IFN-γ和IL-4的細(xì)胞數(shù)目。 結(jié)果： 1 Ad-4×Aβ15疫苗的制備制備的重組腺病毒通過CMV啟動子引導(dǎo)下的IRES順反子表達(dá)盒能同時表達(dá)Aβ及GM-CSF基因，RT-PCR顯示感染的HEK293A中有各自目的基因的mRNA轉(zhuǎn)錄。 2 Ad-4×Aβ15疫苗接種C57BL/6鼠的體液免疫效應(yīng)觀察Ad-4×Aβ15、Ad-Aβ42均誘導(dǎo)C57BL/6鼠產(chǎn)生了高滴度的Aβ特異性的抗體，而Ad-GMCSF未能誘導(dǎo)

10、抗體的產(chǎn)生。免疫接種結(jié)束后，Ad-4×Aβ15組小鼠抗體滴度達(dá)到53.31±15.28 μg/ml，Ad-Aβ42組達(dá)到78.37±21.81 μg/ml。Western blot方法檢測血清中抗Aβ42抗體能與原核表達(dá)的GST-Aβ42融合蛋白特異性結(jié)合。 3 Ad-4×Aβ15疫苗接種Tg2576鼠的體液免疫及細(xì)胞免疫效應(yīng)觀察隨著接種次數(shù)的增加，Ad-4×Aβ15、Ad-Aβ42組小鼠血清抗體滴度逐漸上升，到第10次接種后基

11、本達(dá)到平臺，滴度不再上升。到最后一次接種后滴度分別達(dá)到117.9±22.14 μg/ml和136.36±21.62 μg/ml，兩者之間沒有統(tǒng)計學(xué)差別(P＞0.05)，而且抗體水平的變化趨勢相同。Ad-GMCSF組抗體水平維持在基線水平。 4 Ad-4×Aβ15疫苗接種Tg2576鼠改善認(rèn)知退化及病理變化實驗和安全性評估Morris水迷宮行為學(xué)測試結(jié)果顯示，在定位航行實驗的第3-4天，Ad-4×Aβ15和Ad-Aβ42組平均逃避

12、潛伏期明顯較Ad-GMCSF組短(P＜0.01)。在空間探索實驗穿過平臺的次數(shù)、平臺象限游泳時間的百分比方面，Ad-4×Aβ15和Ad-Aβ42組均比Ad-GMCSF組多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，Ad-4×Aβ15組和Ad-Aβ42組相比，差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。 實驗期間，各組轉(zhuǎn)基因小鼠外觀正常；飲食無明顯變化；毛發(fā)無脫落；精神狀態(tài)好；意識清醒；四肢運動正常；免疫部位未見明顯炎癥反應(yīng)。 疫苗接種

13、后，各組轉(zhuǎn)基因小鼠的腦、肝和腎未見組織結(jié)構(gòu)的病理損害；Perls呈陰性反應(yīng)，表明疫苗接種未導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)腦出血。 結(jié)論： 1.成功制備出高滴度Ad-4×Aβ15疫苗及Ad-Aβ42 AD疫苗，通過克隆入的IRES順反子表達(dá)盒能同時分泌性共表達(dá)Aβ及GM-CSF基因。 2.Ad-4×Aβ15和Ad-Aβ42疫苗均能誘導(dǎo)C57BL/6鼠和Tg2576轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生高滴度Aβ特異性的抗體。 3.和Ad-Aβ42疫

14、苗相比，Ad-4×Aβ15疫苗能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生更向Th2方向極化的免疫反應(yīng)。從而可能避免出現(xiàn)Th1細(xì)胞極化優(yōu)勢的細(xì)胞免疫應(yīng)答所引起的不良反應(yīng)。 4.Ad-4×Aβ15疫苗沒有誘導(dǎo)機體產(chǎn)生針對Aβ42特異性的T細(xì)胞反應(yīng)。4×Aβ15含有新的T細(xì)胞表位，但不含有Aβ的T細(xì)胞表位。 5.Ad-4×Aβ15疫苗接種Tg2576鼠明顯改善了其認(rèn)知退化及病理變化。Ad-4×Aβ15和Ad-Aβ42組行為學(xué)均比對照Ad-GMCSF組明顯