重組四價Aβ-,1-15-基因工程肽的制備.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一種多見于老年人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要臨床表現(xiàn)為認知功能障礙和記憶損害。隨年齡增加，AD的發(fā)病率不斷上升。它的主要病理改變?yōu)榛颊吣X內(nèi)出現(xiàn)β-淀粉樣蛋白(β-amyloidpeptide，Aβ)沉積形成的老年斑，神經(jīng)纖維纏結及神經(jīng)元丟失。從報道首例AD病例到現(xiàn)在已近100年，AD的病因及其病理機制仍不十分明確，目前存在多種學說和假設，其中以Aβ毒性學說為大多數(shù)學者所接受。該

2、學說認為Aβ生成、聚合、沉積，繼而形成老年斑，同時伴隨神經(jīng)元損害，是AD病理機制的中心環(huán)節(jié)。近年的研究對該學說有了進一步補充，認為Aβ寡聚體的形成也是AD致病的主要原因。圍繞Aβ致病學說展開的以β-淀粉樣蛋白為靶的免疫治療是近年AD治療的熱點。 1999年Schenk等人首次報道用化學合成的Aβ<,42>肽疫苗皮下接種AD轉基因鼠，產(chǎn)生了特異性的抗Aβ<,42>抗體，阻止和減少了淀粉樣斑塊的形成。隨后多個獨立實驗室先后發(fā)現(xiàn)采用主

3、動免疫或被動免疫的方法均可以減少或清除AD轉基因鼠腦內(nèi)的淀粉樣斑塊沉積并且改善了動物的記憶功能和認知能力。2001年，Elan公司率先進行了抗老年性癡呆疫苗AN1792(主要成分為Aβ<,42>和佐劑QS-21)的Ⅰ期臨床試驗，取得了良好的效果。但在Ⅱ期臨床試驗中，約6﹪的患者接種后出現(xiàn)了腦脊髓膜炎的癥狀，試驗被迫中止。隨后的尸檢發(fā)現(xiàn)患者腦組織中存在T細胞和巨噬細胞浸潤。通過大量隨訪和實驗，多數(shù)研究者們認為Aβ<,42>肽C末端的T細胞

4、表位激發(fā)了Th1反應，從而誘發(fā)炎癥反應可能是Aβ<,42>肽疫苗免疫產(chǎn)生副作用的主要原因。選擇含有盡量少的引發(fā)細胞免疫的T細胞抗原決定簇，保留引發(fā)體液免疫的B細胞抗原決定簇的Aβ肽亞單位疫苗已成為大多數(shù)研究者的共識。隨后多家實驗室采用化學合成或基因工程的方法制備出不同的Aβ亞單位片段加入不同類型佐劑免疫動物后，發(fā)現(xiàn)具有和Aβ<,42>肽疫苗同樣的免疫效果，同時避免了不良反應。本課題組自2001年開始AD系列疫苗的研究以來，先后合成和構建

5、了MAP-Aβ<,1-15>肽疫苗，s4×Aβ<,1-15> DNA疫苗，GSN×Aβ<,1-15>和His6-4×Aβ<,1-15>融合蛋白疫苗等，在動物實驗上均誘導出了較高的特異性抗體，減少了老年斑的沉積，改善了模型鼠的學習記憶功能。 目的： 本課題在前期研究的基礎上，擬去除前期構建的PQE-4×Aβ<,1-15>載體目的基因前方不相關的基因片段，得到理論上更安全的疫苗。在設計上去除了Aβ的T細胞抗原決定簇，保留了B

6、細胞抗原決定簇避免了Aβ的毒性片段，同時采用柔性肽連接多個抗原片段，選擇較理想的純化標簽和載體，用基因工程的方法制備新的四價Aβ亞單位蛋白疫苗，為開發(fā)出更安全、廉價、效果理想的具有自主知識產(chǎn)權的治療AD的疫苗奠定基礎。 材料和方法： 1.重組原核表達載體PQE30a-2×Aβ<,1-15>的構建及鑒定 本室前期通過基因合成和PCR技術擴增，得到六個甘氨酸連接的Aβ<,1-15>二價B細胞抗原表位基因片段，再用GS

7、GGSG linker串聯(lián)這兩個Aβ<,1-15>二價基因片段，命名為4×Aβ<,1-15>，克隆入PcDNA3.1載體，構建成功了PcDNA3.1-s4×Aβ<,1-15>真核表達載體。本實驗在此基礎上，以PcDNA3.1-S4×Aβ<,1-15>質(zhì)粒為模板，由于Aβ<,1-15>片段四次串聯(lián)重復，在引物設計時引物與模板的匹配不能完全一致，故考慮先擴增兩個Aβ<,1-15>二價基因片段減少非特異性擴增。設計上、下游引物時分別引入Bam

8、HI和SacI酶切位點，經(jīng)PCR擴增出目的基因片段1-2×Aβ<,1-15>。將目的片段純化后酶切克隆入原核表達載體PQE30a中，轉化感受態(tài)細菌后挑取陽性菌落擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并酶切鑒定，根據(jù)電泳情況初步確定陽性克隆，命名為PQE30a-2×Aβ<,1-15>，將菌液送上海生物工程公司測序，進一步鑒定。 2.重組質(zhì)粒PQE30a--4×Aβ<,1-15>的構建及鑒定 根據(jù)測序正確的PQE30a-2×Aβ<,1-15>質(zhì)

9、粒為模板擴增另外兩個Aβ<,1-15>片段，較之以PcDNA3.1-s4×Aβ<,1-15>為模板特異性更高。引物設計時上、下游分別引入SacI和HindlIl酶切位點，經(jīng)PCR擴增出目的基因片段2-2×Aβ<,1-15>。將目的片段純化酶切后克隆入PQE30a-2×Aβ<,1-15>重組質(zhì)粒中，轉化感受態(tài)細菌后挑取陽性菌落擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并酶切鑒定，根據(jù)電泳情況初步確定陽性克隆，命名為PQE30a-4×Aβ<,1-15>，將菌液送上

10、海生物工程公司測序，進一步鑒定。 3.重組表達載體PQE30a-4xAβ<,1-15>在M15中的誘導表達 從E.Coli DH5α中提取重組質(zhì)粒PQE30a-4×Aβ<,1-15>純化后轉化入表達菌E.Coli M15菌株中，摸索表達條件，包括IPTG濃度，誘導時間和誘導溫度，使目的蛋白為可溶性表達，并得到較大表達。表達后裂解菌體，取上清進行SDS-PAGE及Western blotting鑒定，鑒定其表達產(chǎn)物是否為我

11、們所需的可溶的目的蛋白。 4. 目的蛋白His6-4×~Aβ<,1-15>的大量誘導表達及純化 采用優(yōu)化好的誘導條件進行大量表達His6-4×Aβ<,1-15>融合蛋白，利用6×his標簽通過Ni<,2+>-NTA親和層析純化目的蛋白，小量純化摸索純化條件，15﹪SDS-PAGE電泳分析純化效果，大量純化目的蛋白后用超濾濃縮管超濾、濃縮，并進行定量。 結果： 1.構建了重組原核表達載體PQE30a-2×A

12、β<,1-15>以PcDNA3.1-s4×Aβ<,1-15>真核表達質(zhì)粒為模板，相應的引物PCR擴增出目的片段1-2×Aβ<,1-15>基因，其大小為110 bp，且同時正確引入了相應的酶切位點?？寺∪隤QE30a載體后，轉化入DH5α感受態(tài)中，挑取陽性克隆，酶切鑒定的結果表明目的基因已插入至PQE30a，中，測序結果表明重組載體中的2×Ap<,1-15>基因序列與已知序列相符合，未發(fā)現(xiàn)突變的堿基，且密碼子讀框正確。 2.構建了

13、重組原核表達載體PQE30a-4×Aβ<,1-15>以測序正確的PQE30a-2×Aβ<,1-15>為模板，相應的引物PCR擴增出目的片段2-2×Aβ<,1-15>基因，其大小為110 bp，且同時正確引入了相應的酶切位點?？寺∪隤QE30a--2×Aβ<,1-15>載體后，轉化入DH5α感受態(tài)中，挑取陽性克隆，酶切鑒定的結果表明目的基因已插入至PQE30a--2×Aβ<,1-15>中，在220 bp中可見4×Aβ<,1-15>的目的條

14、帶，測序結果表明重組載體中的4×Aβ<,1-15>基因序列與已知序列相符合，未發(fā)現(xiàn)突變的堿基，且密碼子讀框正確。 3.小量表達了目的蛋白His6-4xAβ<,1-15>PQE30a-4×Aβ<,1-15>轉化入EColi M15中，最佳誘導條件為IPTG 1 mM，30℃低溫誘導9 h可以獲得一定表達量的可溶性目的蛋白His6-4×Aβ<,1-15>，15﹪SDS-PAGE電泳在18 KD處可見誘導后有新生目的條帶，且主要在上清

15、中，Western blotting鑒定為我們所需的目的蛋白，可以和抗Aβ<,40>抗體特異性結合，具有免疫反應性。 4.大量表達和純化了His6-4×Aβ<,1-15>融合蛋白以最佳誘導條件大量表達出目的蛋白，用Ni<'2+>-NTA親和層析純化目的蛋白，以40 mM咪唑濃度為洗滌濃度，300 mM咪唑濃度為洗脫濃度，15﹪SDS-PAGE電泳在18 KD處可見單一的目的條帶。純化后的目的蛋白經(jīng)超濾管超濾、濃縮，定量后保存于-

16、20℃。 結論： 1.利用基因工程的原理和技術成功構建了優(yōu)化的原核表達載體PQE30a-4×Aβ<,1-15>，測序結果表明插入的目的基因序列無突變。 2.誘導表達了His<,6-4>×Aβ<,1-15>融合蛋白，且大部分為可溶性表達，并通過Ni<'2+>+-NTA樹脂純化，制備了四價B細胞抗原表位串聯(lián)的Aβ<,1-15>多肽。 3.Western blotting結果顯示制備的His<,6-4>×Aβ<