弓形蟲(chóng)翻譯控制腫瘤蛋白的原核表達(dá)及促進(jìn)組胺釋放活性的研究.pdf

1、弓形蟲(chóng)(Toxoplasma gondii)主要寄生在細(xì)胞內(nèi)，感染弓形蟲(chóng)的地區(qū)是呈全球式分布的，但不同的區(qū)域感染弓形蟲(chóng)的概率存在差異。當(dāng)速殖子快速生長(zhǎng)時(shí)，Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答被快速誘導(dǎo)，從而產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子。組胺是一個(gè)重要的炎性反應(yīng)調(diào)節(jié)因子，是由翻譯控制腫瘤蛋白(Translationally controlled tumor protein，TCTP)刺激嗜堿性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞所產(chǎn)生，從而起到誘發(fā)變態(tài)反應(yīng)和過(guò)敏性炎癥反應(yīng)的作用。TCT

2、P具有高度的保守性，但是有關(guān)弓形蟲(chóng)TCTP蛋白的功能和特性，目前為止并未見(jiàn)到文獻(xiàn)報(bào)道，因此，對(duì)該蛋白組胺釋放因子樣活性和介導(dǎo)宿主炎性反應(yīng)作用的研究將有助于揭示弓形蟲(chóng)的感染機(jī)制，對(duì)弓形蟲(chóng)病的防治以及對(duì)抑制感染該病的傳播是非常重要的。
　　為研究弓形蟲(chóng)感染后產(chǎn)生炎性反應(yīng)的分子機(jī)制，本研究應(yīng)用延伸PCR方法擴(kuò)增弓形蟲(chóng)翻譯控制腫瘤蛋白(TCTP)基因和GST基因，并通過(guò)重疊延伸PCR將TCTP和GST基因融合后，構(gòu)建了pET-30a-TC

3、TP-GST原核表達(dá)的載體;將此載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，同時(shí)利用SDS-PAGE和Western-blot的試驗(yàn)方法對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分析，之后利用Native-PAGE鑒定TgTCTP多聚體存在形式，并應(yīng)用弗氏佐劑制備TgTCTP蛋白亞單位疫苗，接種小鼠制備抗蛋白的血清;利用間接免疫熒光檢測(cè)方法(IFAT)鑒定TgTCTP的定位情況;同時(shí)利用組胺釋放活性的競(jìng)爭(zhēng)性ELISA的檢測(cè)方法鑒定重組TgTCTP蛋白(rTgTCTP)對(duì)小鼠腹腔細(xì)胞釋放組胺

4、的活性的作用。結(jié)果表明，經(jīng)PCR反應(yīng)分別獲得的弓形蟲(chóng)TCTP和GST基因大小為510 bp和690 bp，同時(shí)融合的TCTP和GST基因長(zhǎng)度為1200 bp，構(gòu)建了pET-30a-TCTP-GST的重組質(zhì)粒;同時(shí)利用SDS-PAGE的試驗(yàn)檢測(cè)到該重組質(zhì)粒表達(dá)蛋白的分子量是47 ku，同時(shí)發(fā)現(xiàn)該蛋白具備良好的反應(yīng)原性;檢測(cè)到抗TgTCTP的小鼠血清多克隆抗體可以識(shí)別出19 ku弓形蟲(chóng)蟲(chóng)體天然蛋白;TgTCTP能夠分泌到胞漿內(nèi);重組TgTC