弓形蟲MAG1蛋白的原核表達及ELISA檢測方法的建立.pdf

1、剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)呈全球性分布，專性細胞內寄生，能導致人獸共患的弓形蟲病。弓形蟲感染可引發(fā)很多頑癥如腦病和眼病等，引起母畜流產(chǎn)、死胎，并可對免疫缺陷動物產(chǎn)生致死效果，對畜牧業(yè)危害比較嚴重。
　　 MAG1是一種位于組織包囊基質部位的蛋白，由于只能在緩殖子階段的包囊的提取物中被檢測到，而不能通過免疫印跡在速殖子內檢測到，曾一度被認定為是緩殖子階段特異表達的蛋白。后來一些學者發(fā)現(xiàn)MAG1也能在包裹速殖子

2、的納蟲泡內被檢測到，RT-PCR方法和微陣列實驗的結果也支持了這種觀點。很多學者研究發(fā)現(xiàn)，MAG1具有優(yōu)良的免疫原性，可刺激宿主產(chǎn)生高滴度的抗體，不僅能為宿主提供免疫性保護，還可為弓形蟲的免疫學檢測提供候選蛋白。
　　 本研究旨在建立弓形蟲重組MAG1蛋白間接ELISA檢測體系，首先對編碼弓形蟲基質抗原MAG1基因進行了PCR擴增并原核表達，然后純化MAG1重組蛋白免疫大白兔，制備抗血清，再用重組MAG1蛋白包被96孔酶免疫反應

3、板，采用重組MAG1蛋白免疫大白兔獲得的抗血清作為第一抗體，HRP酶標SPA作為第二抗體，OPD作為酶反應底物，建立基于MAG1蛋白的間接ELISA方法。
　　 測序結果表明，克隆所得的基因片段為目的基因片段。SDS-PAGE和western-blot結果表明，表達的重組蛋白為重組MAG1蛋白。該重組蛋白在用Ni2+NTA親和層析法進行純化時，最佳洗脫液液為含8M尿素和100mM咪唑的pH為7.4的PBS溶液。最終建立的間接EL