人參皂甙Rg1對絕經(jīng)后婦女阿爾茨海默病細胞模型的神經(jīng)保護作用及機理研究.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是以進行性加重的記憶認知功能減退為主要臨床特點的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。AD是引起癡呆的最常見原因，是老年人的常見病、多發(fā)病，最早是在1907年由德國醫(yī)師Alosis Alzeimer's報道。AD通常起病隱匿，為特點性、進行性病程，無緩解，由發(fā)病至死亡平行病程約8-10年，但也有些患者病程可持續(xù)15年或以上。AD主要病理學特征是在大腦皮層和海馬區(qū)域β-淀粉樣蛋白(beta-a

2、myloid protein，A B)沉淀形成的老年斑(senile plaque，SP)和tau蛋白異常磷酸化形成的神經(jīng)元纖維纏結(neur-ofillary tangles，NFT)以及出現(xiàn)彌漫性腦萎縮，表現(xiàn)為認知功能的進行性減退，伴有人格和情感控制等方面的異常以及日常生活能力的下降。
　　 有統(tǒng)計顯示：在美國65歲以上有1/10、85歲以上有近35％的人患AD，這樣計算下來美國有超過450萬AD患者，預計這一數(shù)據(jù)在2030

3、年將達到900萬人，2050年將達到2500萬人，目前，全世界有2500萬人有輕微的記憶障礙，很顯然幾年之后就會被診斷為AD。世界衛(wèi)生組織估計全球85歲以上人群中約有30％患有AD。在發(fā)達國家，AD已成為繼心臟病、癌癥、中風之后的第四大疾病。AD的社會影響是極大的，僅在美國，每年用于AD的費用將近1100億美元。我國是一個人口大國，人口老齡化的速度會更快，現(xiàn)在我國60歲以上人口已經(jīng)超過10％，因而患癡呆的人數(shù)將有顯著增加，特別是在較高齡

4、人口中該病的患病率會成倍增長。國內(nèi)有學者對中國東北、西北、東南、西南4個地區(qū)3960萬人群進行分層、多級、整群抽樣研究，經(jīng)加權調(diào)整抽樣誤差后的結果顯示，55歲以上人群AD患病粗略合計為2.0％，65歲以上為3.5％。日趨增多的AD患者將會給患者家庭及社會帶來極大危害。
　　 近來研究發(fā)現(xiàn)，除年齡、遺傳和環(huán)境因素外，性激素，尤其是雌激素也在AD的發(fā)病中有重要的作用。流行病學研究顯示，AD的發(fā)病有明顯的性別差異，女性和男性患者之比為

5、2:1-3:1。除了女性平均壽命較長的原因外，絕經(jīng)后婦女體內(nèi)雌激素水平的迅速下降增加了其對AD的易感性，提示雌激素不足與AD之間存在某種聯(lián)系，雌激素缺乏可能是AD的危險因素。因此，女性絕經(jīng)后老年癡呆已成為AD的重要類型。雌激素替代治療(ERT)能延緩女性AD患者的發(fā)病年齡。然而，我們也不得不認識到ERT所帶來的弊端。應用ERT的婦女，不論是否已做子宮切除術，卵巢癌、乳腺癌等發(fā)病危險均有所增加，而且發(fā)病危險與ERT使用時間成正比。這是目前

6、制約ERT在臨床上應用的一個主要原因。因此，具有雌激素樣作用的中藥單藥或者復方的研究受到了越來越多的關注。中醫(yī)理論認為“心主藏神”、“腎主骨髓”、“腦為元神之府”，心之氣血不足，腎之精氣虧損，腦之髓海失充為導致記憶障礙的關鍵。人參性稟中和，功善滋補強壯，是傳統(tǒng)大補元氣，調(diào)神益智的常用中藥。人參皂苷Rg1是已發(fā)現(xiàn)的40多種人參皂苷中研究較多的一種人參單體，其主要的靶器官是中樞神經(jīng)系統(tǒng)。現(xiàn)代藥理學研究表明人參皂甙Rg1是人參作用于神經(jīng)系統(tǒng)和

7、促智的主要有效成分之一，具有抗衰老、抗氧化、提高免疫力和增強記憶力等作用。
　　 本研究選用Aβ25-35作用于原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元作為AD的細胞模型，通過流式細胞儀檢測人參皂甙Rg1的抗神經(jīng)元凋亡作用，并且應用熒光實時定量PCR(realtime PCR)及Western Blot檢測凋亡相關因子以及雌激素受體的表達以探討人參皂甙Rg1神經(jīng)保護作用的機制，從而為臨床相關疾病的治療提供科學依據(jù)。
　　 目的：

8、　　 本實驗研究選用Aβ25-35作用于原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元作為AD的細胞模型，探討人參皂甙Rg1的類雌激素樣神經(jīng)保護作用機制，為臨床相關疾病的治療提供科學依據(jù)。
　　 方法：
　　 本研究共分為以下兩個部分：
　　 第一部分原代神經(jīng)元的培養(yǎng)及阿爾茨海默病細胞模型的制備
　　 取新生24小時內(nèi)的Wistar大鼠，剝離腦膜、分離出海馬，加入0.125％胰蛋白酶溶液消化，用含有10％胎牛血清的DMEM/

9、F12培養(yǎng)液終止消化，反復吹打制成單細胞懸液，于37℃孵箱中孵育，定時在倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及生長情況。將經(jīng)過多聚賴氨酸包被的玻片鋪于24孔板中，將細胞接種在玻片上，體外原代培養(yǎng)7天后，采用免疫細胞化學染色方法，檢測神經(jīng)元特異性標記物--Microtubule-associated protein-2(MAP-2)的表達。
　　 將Aβ25-35用生理鹽水溶解，然后用DMEM/F12培養(yǎng)液稀釋，過濾滅菌，分裝在EP管中置

10、于-20℃冰箱保存，用前在37℃孵箱中孵育7天。海馬神經(jīng)元培養(yǎng)7天后，加入老化處理好的Aβ25-35，使Aβ25-35的終濃度分別為0μmol/1、2.5μmol/1、5μmol/1、7.5μmol/1、10μmol/l，分別作用24h、48h、72h，用MTT法及LDH檢測細胞活力，從而確定合適的Aβ25-35作用濃度及作用時間。
　　 第二部分人參皂甙Rg1緩解Aβ25-35引起的細胞毒性作用及機理研究
　　 MTT

11、法及LDH的測定來檢測人參皂甙Rg1緩解Aβ25-35的細胞毒性作用；AnnexinV/PI雙染法檢測人參皂甙Rg1對抗Aβ25-35所導致的細胞凋亡；實時定量RT-PCR法檢測Bcl-2、Bax、caspase3、ERα、ERβ mRNA的表達，免疫印記法(Western blot)檢測Bcl-2、Bax、active caspase3、ERα、ERβ蛋白的表達。
　　 結果：
　　 第一部分原代神經(jīng)元的培養(yǎng)及阿爾茨海

12、默病細胞模型的制備
　　 1.Aβ25-35損傷模型的制備Aβ25-35的神經(jīng)元毒性呈劑量和時間依賴性。各濃度Aβ25-35作用時間為24h和48h時，均未對神經(jīng)元產(chǎn)生明顯的細胞毒性，而在作用時間為72h時的細胞毒性明顯增強。MTT和LDH結果均顯示，相比其他作用濃度Aβ25-35在濃度為5μmol/l時對神經(jīng)元的細胞毒性作用最大并且之后達到一個平臺期。因此，我們最終選擇5μmol/1的Aβ25-35作用72h來進行進一步的實驗

13、。
　　 2.神經(jīng)元形態(tài)學改變神經(jīng)元在培養(yǎng)到大約第7天時，胞體形態(tài)飽滿，呈錐形或梭形，折光性強，有明顯立體感，核仁清晰可見，突起增多、增粗、變長，并出現(xiàn)末端分枝，連成神經(jīng)網(wǎng)絡。Model組與Control組相比較，細胞數(shù)目有所減少，折光性減弱，部分細胞變圓，細胞核呈固縮狀態(tài)，胞體腫脹，失去原有形態(tài)，神經(jīng)元突起減少、變短甚或消失。人參皂甙Rg1各組和E2組與Model組相比較，細胞損傷相對較小，細胞形態(tài)基本完好。
　　 第

14、二部分人參皂甙Rg1緩解Aβ25-35引起的細胞毒性作用及機理研究
　　 1.人參皂甙Rg1緩解Aβ25-35的細胞毒性作用MTT和LDH結果均顯示，Model組的細胞活力明顯低于Control組(P<0.01)：相比Model組，人參皂甙Rg1各組和E2組的細胞活力均有提高，均有顯著性意義(P<0.01或P<0.05)；E2組的細胞活力高于Rg110-8M組、Rg110-7M組和Rg110-6M組，但無統(tǒng)計學意義(P>0.05

15、)。
　　 2.人參皂甙Rg1對抗Aβ25-35所導致的細胞凋亡熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，早期凋亡的細胞表現(xiàn)為細胞膜綠色熒光染色而細胞核無染色；晚期凋亡的細胞表現(xiàn)為AnnexinV和PI雙染，即胞膜綠染、核紅染。Control組各個時期凋亡細胞均極少；Model組較多細胞膜綠染，也有少數(shù)細胞核紅染；而加入雌激素和人參皂甙Rg1后，早期凋亡細胞和晚期凋亡細胞數(shù)目均明顯減少。流式細胞儀分析結果示：Model組早期凋亡細胞的數(shù)量明顯多于C

16、ontrol組(P<0.01)；人參皂甙Rg1各組和E2組早期凋亡細胞的數(shù)量與Model組比較均有所減少(P<0.05)；E2組與Rg110-7M組和Rg110-6M組早期凋亡細胞的數(shù)量大致相當，無顯著性差異(P>0.05)，但是均比Rg110-8M組有明顯降低(P<0.05)。
　　 3.實時定量RT-PCR法檢測Bcl-2、Bax、caspase3、ERα、ERβ mRNA的表達(1)Bcl-2 mRNA表達比較Model組

17、Bcl-2 mRNA的表達較Control組有所增高(P<0.01)，人參皂甙Rg1各組和E2組Bcl-2 mRNA的表達均比Model組有所提高(P<0.01或0.05)；(2)Bax mRNA表達比較Model組Bax mRNA的表達比Control組明顯增高(P<0.01)，人參皂甙Rg1各組和E2組mRNA的表達水平較Control組均有顯著降低(P<0.01或P<0.05)：(3)Bcl-2/Bax mRNA表達比較與Cont

18、rol組比較，Model組Bcl-2/Bax的比值明顯降低(P<0.01)，人參皂甙Rg1各組和E2組Bcl-2/Bax的比值較Model組顯著提高(P<0.01或P<0.05)；(4)caspase3 mRNA表達比較與Control組比較，Model組caspase3 mRNA的表達顯著升高(P<0.01)，人參皂甙Rg110-7M組、人參皂甙Rg110-6M組和E2組caspase3 mRNA的表達較Model組均有明顯降低(P<

19、0.01)，但是人參皂甙Rg110-8M組caspase3 mRNA的表達與Model組比較沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)；(5)ERαmRNA表達比較Control組有ERαmRNA的表達，Model組比Control組ERαmRNA表達顯著降低(P<0.05)，人參皂甙Rg1各組和E2組ERαmRNA表達水平相比Model組則有所提高，但是沒有顯著性差異(P>0.05)；(6)ERβmRNA表達比較Control組有ERβ mRNA

20、的表達，與Control組比較，Model組ERβ mRNA表達水平顯著降低(P<0.01)，人參皂甙Rg1各組和E2組ERβ mRNA表達水平較Model組有顯著提高(P<0.01或P<0.05)。
　　 4.免疫印記法(Western blot)檢測Bcl-2、Bax、active caspase3、ERβ、ERβ蛋白的表達水平(1)Bcl-2蛋白表達比較Model組Bcl-2蛋白的表達較Control組增高(P<0.05)

21、，人參皂甙Rg1各組和E2組Bcl-2蛋白的表達均比Model組有所提高(P<0.01或(P<0.05)，在人參皂甙Rg1各組和E2組中Rg110-7M組Bcl-2蛋白的表達最高，但無顯著性差異(P>0.05)；(2)Bax蛋白表達比較與Control組比較，Model組Bax蛋白表達水平明顯增高(P<0.01)，人參皂甙Rg1各組和E2組Bax蛋白表達水平較Control組均有顯著降低(P<0.05)；(3)Bcl-2/Bax表達比較

22、與Control組比較，Model組Bcl-2/Bax的值明顯降低(P<0.01)，人參皂甙Rg1各組和E2組Bcl-2/Bax的值較Model組顯著提高(P<0.01)，其中E2組Bcl-2/Bax的比值提高最多，但是沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)；(4)active caspase3蛋白表達比較Model組active caspase3蛋白表達水平高于Control組(P<0.01)，與Model組比較，人參皂甙Rg1各組和E2組a

23、ctive caspase3蛋白表達水平均有降低(P<0.01或P<0.05)。(5)ERα蛋白表達比較Control組有ERα蛋白表達，Model組ERα蛋白表達較Control組明顯降低(P<0.01)，與Model組相比，人參皂甙Rg1各組和E2組ERα蛋白表達均有所提高，但是沒有顯著性差異(P>0.05)；(6)ERβ蛋白表達比較Control組有ERβ蛋白表達，Model組比Control組ERβ蛋白表達顯著降低(P<0.01

24、)，加入人參皂甙Rg1和E2后ERβ蛋白表達水平均有顯著提高(P<0.05或P<0.01)。
　　 結論：
　　 1.人參皂甙Rg1與雌激素都能夠緩解Aβ25-35的神經(jīng)元毒性作用。人參皂甙Rg1的神經(jīng)保護作用可能與其能對抗Aβ25-35所導致的神經(jīng)元凋亡密切相關。
　　 2.人參皂甙Rg1與雌激素均可以增加抗凋亡因子Bcl-2 mRNA及蛋白水平的表達、降低促凋亡因子Bax mRNA及蛋白水平的表達，從而上調(diào)了

25、Bcl-2/Bax的比值，并最終引起了caspase3 mRNA和active caspase3蛋白水平表達的降低，這可能是人參皂甙Rg1的抗神經(jīng)元凋亡作用機理之一。
　　 3.體外培養(yǎng)的原代海馬神經(jīng)元中ERα、ERβ共表達，ERβ的表達是ERα表達的2.3倍。
　　 4.雌激素受體表達減少在AD發(fā)病中起重要作用。人參皂甙Rg1的神經(jīng)保護作用原因之一是因為其具有類雌激素樣作用，并且這種作用主要是通過ERβ來實現(xiàn)的而不是E