熱休克蛋白90在HepG2細胞氧化應激與適應中的作用研究.pdf

1、研究背景 不斷變化的環(huán)境影響著所有生存在其中的有機體，使細胞受到來自內(nèi)部和外部的各種應激和損傷。機體必須適應環(huán)境的改變才得以存活，因此需要細胞基因組做出程序性的應答，導致效應蛋白質(zhì)的變化來滿足細胞適應環(huán)境改變的要求。氧化應激，是由于ROS(reactiveoxygenspecies)產(chǎn)生和消除之間的不平衡引起的，會導致人體多種疾病和細胞損傷。不同強度的氧化應激可觸發(fā)細胞內(nèi)兩條相反的應答途徑：一條導致細胞死亡，另一條引起細胞短暫的

2、非致死性的生理改變，后者的主要特征是適應和保護。預適應是細胞或者組織在亞致死性應激后對應激的抵抗性。熱休克蛋白90(Heatshockprotein90,Hsp90)是熱休克蛋白家族中的一員，在應激情況下，可以與細胞內(nèi)的多種信號通路相互協(xié)調(diào)作用，與細胞損傷和保護密切相關。在氧化應激和適應中，Hsp90與應激損傷和保護關系如何，是通過何種途徑發(fā)揮作用的，仍有待闡明。 目的 1.通過氧化應激和預適應建立HepG2細胞氧化應激

3、適應模型； 2.研究在氧化應激和適應條件下，HepG2細胞活性和細胞內(nèi)Hsp90表達情況； 3.建立穩(wěn)定的Hsp90α下調(diào)表達和Hsp90β高表達HepG2細胞株，探討不同Hsp90表達水平在氧化應激下對細胞活性的影響。 方法 1.建立預適應及氧化應激HepG2細胞模型：將細胞分為對照組、預適應組、氧化應激組和預適應后氧化應激組。預適應因素：50tmol/LH2O2，2h，普通培養(yǎng)基孵育24h，氧化應激因

4、素：500μmol/LH2O2，24h。通過AO/EB雙染色法、MTT比色法和PI染色流式細胞術觀察細胞在不同條件下的存活情況。 2.穩(wěn)定的Hsp90α下調(diào)表達和Hsp90β高表達HepG2細胞株的建立：進行pSilencerHSP90α和pSmycHSP90β質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染：經(jīng)過質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、提取和純化以及瓊脂糖凝膠電泳的初步篩選和測序鑒定，將重組的pSilencerHSP90α和pSmycHSP90β質(zhì)粒以電穿孔法轉(zhuǎn)染入HepG2細

5、胞中，經(jīng)過G418篩選、傳代，建立穩(wěn)定的Hsp90α下調(diào)表達和Hsp90β高表達細胞株。并用蛋白質(zhì)免疫印跡法(western-blotting)檢測胞內(nèi)Hsp90表達變化，繪制轉(zhuǎn)染后細胞生長曲線。 3.應用MTT比色法測定Hsp90α下調(diào)表達和Hsp90β高表達對氧化應激處理后的細胞存活狀態(tài)的影響。 4.應用western-blotting方法檢測對照組和轉(zhuǎn)染后的細胞在氧化應激中Hsp90的含量變化。 結(jié)果

6、 1.AO/EB雙染色結(jié)果：各組細胞經(jīng)AO/EB雙染色后呈現(xiàn)不同的染色狀態(tài)：對照組細胞為正常梭形，呈均勻綠色熒光染色；預適應組可見少量綠色濃染細胞；氧化應激組可見大量綠色或紅色濃染凋亡細胞；預適應后氧化應激組凋亡細胞明顯少于氧化應激組。 2.MTT比色法結(jié)果：MTT比色法測定細胞生存活力比較：對照組＞預適應組＞預適應后氧化應激組＞氧化應激組(P＜0.05)。 3.PI染色流式細胞術結(jié)果：PI染色流式細胞術測細胞凋亡率比

7、較：氧化應激組＞預適應后氧化應激組＞預適應組＞對照。(P＜0.05) 4.重組質(zhì)粒的瓊脂糖凝膠電泳初篩：小量提取質(zhì)粒后，挑選重組質(zhì)粒；DNA測序鑒定結(jié)果提示目的基因片段正確插入；轉(zhuǎn)染后細胞的western-blotting的鑒定結(jié)果：轉(zhuǎn)染pSmycHSP90β質(zhì)粒的細胞蛋白表達條帶積分光密度高，轉(zhuǎn)染pSilencerHSP90α質(zhì)粒的細胞蛋白表達條帶積分光密度低，對照組細胞的蛋白表達條帶積分光密度介于前兩者之間。 5.轉(zhuǎn)

8、染pSilencerHSP90α和pSmycHSP90β質(zhì)粒的細胞生長曲線與對照組相比，生長情況無差別。 6.Hsp90α下調(diào)表達和Hsp90β高表達對氧化應激處理后的細胞存活狀態(tài)的影響：Hsp90α下調(diào)表達組的細胞生存活力大幅度下降(P＜0.01)，Hsp90β高表達組的細胞生存活力＜預適應后氧化應激組(P＜0.01)。 7.氧化應激后細胞內(nèi)Hsp90含量的western-blotting鑒定結(jié)果：各組光密度值比較：對

9、照組＞hsp90β高表達組＞預適應組＞預適應后氧化應激組＞氧化應激組＞hsp90α下調(diào)表達組。 結(jié)論 1.不同濃度H2O2作用于HepG2細胞產(chǎn)生預適應和氧化應激現(xiàn)象，應用小劑量H2O2作用于細胞可以保護細胞免受更大濃度H2O2帶來的損傷。 2.應用電轉(zhuǎn)染法可以使pSilencerHSP90α和pSmycHSP90β質(zhì)粒在HepG2細胞中穩(wěn)定表達。 3.Hsp90β主要是細胞生理情況下的構(gòu)成型表達，在氧化