TGF-β1、bFGF雙基因修飾BMSCs的體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：分別構(gòu)建含人堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)基因的真核表達(dá)載體和含人轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growthfactor-β1，TGF-β1)基因的真核表達(dá)載體，用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法將這兩種真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)，探討bFGF與TGF-β1雙基因能否共

2、同修飾BMSCs及對它的增殖是否具有協(xié)同作用，為聯(lián)合利用基因工程技術(shù)和牙周組織工程技術(shù)修復(fù)牙槽骨缺損提供初步實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：通過PCR方法從質(zhì)粒pDONR223-bFGF、pDONR223-TGF-β1中獲得人bFGF和人TGF-β1基因，將這兩種目的基因克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)上，構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-bFGF和pcDNA3.1(+)-TGF-β1，用酶切和測序的方法來鑒定重組真核表達(dá)載體

3、是否構(gòu)建成功。分離培養(yǎng)SD大鼠BMSCs，用流式細(xì)胞儀鑒定其表面標(biāo)志物。將構(gòu)建成功的兩種真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染BMSCs，RT-PCR和Western blot分別從mRNA水平和蛋白質(zhì)水平檢測BMSCs中bFGF和TGF-β1基因的表達(dá)。通過MTT法檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的增殖情況，各組光密度值（OD值）均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示，兩兩樣本均數(shù)比較用t檢驗(yàn)，應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4、>　　結(jié)果：⑴真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-bFGF和pcDNA3.1(+)-TGF-β1經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后，電泳后顯示有468bp、1173bp的人bFGF和人TGF-β1目的基因片段及5428bp的線性化pcDNA3.1(+)載體片段。目的基因人bFGF的測序結(jié)果與經(jīng)過優(yōu)化的人bFGF基因堿基序列基本一致，人bFGF基因于447位有1個(gè)堿基突變:G→T，于467位有1個(gè)堿基突變:A→G，均為同義突變。目的基因人TGF-β1的

5、測序結(jié)果與GenBank中的人TGF-β1基因堿基序列一致，無堿基突變。說明構(gòu)建的真核表達(dá)載體中含有人bFGF和人TGF-β1基因。⑵真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-bFGF和pcDNA3.1(+)-TGF-β1轉(zhuǎn)染SD大鼠BMSCs24h后，通過RT-PCR和Western blot檢測到bFGF、TGF-β1基因的表達(dá)，其蛋白分子量分別約為18kD和25kD。共轉(zhuǎn)染組中既有bFGF基因的表達(dá)也有TGF-β1基因的表達(dá)。⑶真核表達(dá)

6、載體pcDNA3.1(+)-bFGF和pcDNA3.1(+)-TGF-β1轉(zhuǎn)染SD大鼠BMSCs24h后，對各組MTT OD值進(jìn)行比較:pcDNA3.1(+)-bFGF組、pcDNA3.1(+)-TGF-β1組、 pcDNA3.1(+)-bFGF+pcDNA3.1(+)-TGF-β1組、pcDNA3.1(+)組的OD值均高于空白對照組(P＜0.01);pcDNA3.1(+)-bFGF組、pcDNA3.1(+)-TGF-β1組、pcDNA

7、3.1(+)-bFGF+pcDNA3.1(+)-TGF-β1組的OD值均高于pcDNA3.1(+)組（P＜0.01）;pcDNA3.1(+)-bFGF組的OD值高于pcDNA3.1(+)-bFGF+pcDNA3.1(+)-TGF-β1組(P＜0.01);pcDNA3.1(+)-TGF-β1組OD值與pcDNA3.1(+)-bFGF+pcDNA3.1(+)-TGF-β1組的OD值比較，P＞0.05，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：①