甘藍(lán)和白菜PG基因家族成員的比較與BoMF25和BcMF26的功能鑒定.pdf

1、多聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturonase，PG）是一類細(xì)胞壁水解酶。在植株生長發(fā)育的細(xì)胞分離事件中，它通過降解果膠發(fā)揮重要作用。PG基因家族眾多成員間在基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)方式上存在變異和分化，并且許多成員間可能存在功能冗余。在全基因組重復(fù)和串聯(lián)重復(fù)等重復(fù)事件發(fā)生的過程中，產(chǎn)生了許多重復(fù)PG基因。伴隨著基因組片段的碎片化和重排，造成了PG基因的分化和丟失。前人已經(jīng)對(duì)若干物種的PG基因家族成員的進(jìn)化和分類進(jìn)行了一定程度的探討。但是在

2、PG基因家族擴(kuò)張的模式和程度、作用于PG基因家族擴(kuò)張的機(jī)制，重復(fù)PG基因的表達(dá)特征和差異、PG基因家族成員的丟失和保留機(jī)制、種間存在共線性的PG基因的功能鑒定等方面尚不甚明了。在種子植物的有性生殖過程中，花粉與授粉受精和后代繁衍有關(guān)?；ǚ蹆?nèi)壁和花粉管壁的主要成分均為果膠，PG與花粉發(fā)育和花粉管形成密切相關(guān)。單個(gè)PG基因在花粉發(fā)育和花粉管形成過程中可能的功能已經(jīng)在許多物種中被鑒定，但是對(duì)于重復(fù)PG基因在這一過程中的表達(dá)差異和功能分化的研究

3、還鮮有報(bào)道。
　　我們以蕓薹屬物種甘藍(lán)和白菜為實(shí)驗(yàn)材料，結(jié)合已經(jīng)公布的全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)和本課題組前期獲得的白菜PG基因的序列和表達(dá)數(shù)據(jù)，對(duì)甘藍(lán)PG基因家族成員的表達(dá)和進(jìn)化進(jìn)行了深入研究，并對(duì)白菜和甘藍(lán)PG基因家族成員擴(kuò)張的模式和程度、進(jìn)化過程中的保留和丟失情況、重復(fù)PG基因的表達(dá)特征和差異，以及在兩個(gè)物種存在共線性的PG基因在三個(gè)亞基因組上的分布進(jìn)行了比較。針對(duì)在種間存在共線性的PG基因發(fā)生丟失和重復(fù)PG基因間存在表達(dá)差異等問題，

4、我們對(duì)在白菜中的共線性基因發(fā)生丟失的甘藍(lán)PG基因BoMF25（基因ID: Bol018697）以及白菜重復(fù)基因BcMF26a（基因ID: Bra011440）和BcMF26b（基因ID: Bra037005）進(jìn)行了深入研究。獲得的主要結(jié)果和結(jié)論如下:
　　(1)在甘藍(lán)中鑒定到了102個(gè)PG基因。利用氨基酸全序列構(gòu)建進(jìn)化樹，依據(jù)氨基酸序列的相似性，甘藍(lán)PG被劃分為A～H八個(gè)亞類。分析不同亞類成員拷貝數(shù)目的變化，發(fā)現(xiàn)進(jìn)化過程中，A～F

5、亞類的成員存在較高比例的獲得和丟失。通過qRT-PCR分析，發(fā)現(xiàn)A和E亞類的成員幾乎在根、莖、葉片、花序和嫩角果組織中都有表達(dá);B亞類成員除了葉片中沒有表達(dá)外，在其他器官中均有表達(dá);C、D和F亞類成員則主要在生殖器官花序和角果中表達(dá)。共同祖先基因的推測(cè)結(jié)果表明，白菜和擬南芥PG成員至少存在76個(gè)推測(cè)的共同祖先基因，甘藍(lán)與擬南芥則至少存在82個(gè)。在與擬南芥分離之后，白菜PG基因家族相較于甘藍(lán)發(fā)生了更加快速的擴(kuò)張。對(duì)PG基因保留率進(jìn)行分析，

6、發(fā)現(xiàn)在全基因組三倍化后，白菜PG基因家族成員的保留率高于甘藍(lán)。比較重復(fù)PG基因的時(shí)空表達(dá)特征，結(jié)果表明，重復(fù)PG基因間的表達(dá)差異存在4種主要表現(xiàn)形式:表達(dá)方式相同或是均不表達(dá)，表達(dá)部位部分重疊但又存在分化，一個(gè)基因不表達(dá)而另一個(gè)基因選擇性地在植株某些器官中表達(dá)，以及在不同器官中表達(dá)。通過比較在白菜和甘藍(lán)三個(gè)亞基因組上共線性PG基因的分布，發(fā)現(xiàn)其分布情況基本一致，但也存在其中一個(gè)物種中的共線性基因發(fā)生丟失的現(xiàn)象。
　　(2)同源比對(duì)

7、結(jié)果表明，Brassica oleracea Male Fertility25(BoMF25)為擬南芥PG基因At4g35670的同源基因。通過擬南芥、甘藍(lán)與白菜基因組間的共線性分析，發(fā)現(xiàn)BoMF25在白菜中的共線性基因是由于基因重復(fù)過程中其所在染色體區(qū)塊發(fā)生了碎片化和重排而丟失。通過qRT-PCR分析，結(jié)果表明，BoMF25主要在花粉發(fā)育晚期的花藥中表達(dá)。通過啟動(dòng)子順式調(diào)控元件和保守基序預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)其推測(cè)的啟動(dòng)子序列含有經(jīng)典的順式調(diào)控元

8、件和花粉特異的基序。利用啟動(dòng)子活性分析，發(fā)現(xiàn)其可以驅(qū)動(dòng)GUS基因在花粉發(fā)育晚期花藥中的表達(dá)。通過原位雜交分析結(jié)果表明，表達(dá)信號(hào)特異出現(xiàn)在成熟花粉粒中。亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，BoMF25可以被定位到細(xì)胞壁上，說明其可能是作用于花粉壁上的分泌蛋白。
　　(3)同源比對(duì)結(jié)果表明，Brassica campestris Male Fertility26a（BcMF26a）和BcMF26b是擬南芥PG基因At4g33440的同源基因。通過

9、共線性分析發(fā)現(xiàn)，BcMF26a和BcMF26b是由進(jìn)化過程中染色體區(qū)段化的重復(fù)產(chǎn)生的。qRT-PCR分析結(jié)果表明，在白菜不同組織器官中，BcMF26b的表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于BcMF26a。通過啟動(dòng)子活性分析，發(fā)現(xiàn)在生殖生長期，BcMF26b啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS基因在絨氈層、花粉粒和雌蕊發(fā)育晚期表達(dá)，而BcMF26a啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS活性只在花蕾發(fā)育早期的雌蕊中表達(dá)。它們?cè)谶M(jìn)化過程中可能發(fā)生了新功能化和亞功能化。通過序列相似性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)它們的調(diào)控序

10、列之間和內(nèi)含子序列之間的相似性均較低，說明可能是調(diào)控序列間和內(nèi)含子序列間的差異導(dǎo)致了其表達(dá)差異。分析At4g33440的T-DNA插入突變體的表型，發(fā)現(xiàn)At4g33440的缺失表達(dá)延緩了花粉管的生長速度。利用amiRNA技術(shù)共同抑制BcMF26a和BcMF26b的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)表達(dá)受抑制的轉(zhuǎn)基因植株的花粉內(nèi)壁發(fā)育異常，花粉管不能正常生長。亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，BcMF26a和BcMF26b定位在細(xì)胞壁上。結(jié)合BcMF26a在不同組織器官中