球孢白僵菌的退化與DNA甲基化關(guān)系的初步研究.pdf

1、球孢白僵菌Beauveria bassiana（以下簡稱白僵菌）具有侵染力強、分布廣以及流行快的特點；同時也具有易于培養(yǎng)，不污染環(huán)境等優(yōu)勢。因此，作為重要的昆蟲病原真菌，白僵菌目前已廣泛應(yīng)用于農(nóng)林業(yè)害蟲生物防治。然而，在實驗室培養(yǎng)和工業(yè)生產(chǎn)過程中，白僵菌也普遍存在著菌體退化問題。白僵菌菌體退化對于其發(fā)酵生產(chǎn)及殺蟲效果有著直接的負(fù)面影響。研究表明，DNA甲基化修飾普遍存在于生物生命過程中。它通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)使生物體在生長發(fā)育過程中產(chǎn)生出不

2、同的性狀。因此，揭示球孢白僵菌在培養(yǎng)過程中菌體退化與其DNA甲基化的關(guān)系，可以為今后進(jìn)一步研究白僵菌表觀遺傳學(xué)以及DNA甲基化在菌體生長發(fā)育機制中的具體功能提供基礎(chǔ)材料和科學(xué)依據(jù)，同時也將為白僵菌的規(guī)?；l(fā)酵與產(chǎn)業(yè)化奠定更加堅實的理論基礎(chǔ)。
　　本研究采用RACE技術(shù)克隆出球孢白僵菌DNA甲基轉(zhuǎn)移酶編碼基因Dim-2全序列，并通過生物信息學(xué)方法，對該蛋白進(jìn)行了同源序列比對與系統(tǒng)發(fā)育樹分析。同時，本研究還利用Realtime-PCR

3、技術(shù)和HPLC技術(shù)對球孢白僵菌在生長發(fā)育過程中Dim-2基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)以及基因組DNA中5-甲基胞嘧啶的含量進(jìn)行了檢測，分析了球孢白僵菌生長發(fā)育過程中DNA甲基化的變化情況。
　　序列分析表明，球孢白僵菌Dim-2基因cDNA序列全長為4021bp，編碼了1142個氨基酸。其5’非翻譯區(qū)（5’-UTR）與3’非翻譯區(qū)（3’-UTR）分別為283個核苷酸和303個核苷酸。預(yù)測的白僵菌DIM-2編碼蛋白分子量為128kD，理論等電點6

4、.13。利用NCBI提供的蛋白保守區(qū)數(shù)據(jù)庫（CDD）平臺對球孢白僵菌Dim-2基因編碼蛋白保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測。結(jié)果顯示，該蛋白含有能催化合成5-甲基胞嘧啶的活性區(qū)域以及一個BAH結(jié)構(gòu)域。蛋白多序列比對與進(jìn)化樹分析顯示，球孢白僵菌Dim-2基因編碼蛋白與GenBank中已登錄注釋的蛹蟲草(Cordyceps militaris)、輪枝菌（Verticillium alboatrum）、粗糙脈孢霉（Neurospora crassa）、巴西

5、芽生菌(Paracoccidioides brasiliensis)等11種真菌的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶具有高度同源性。包括白僵菌DIM-2編碼蛋白在內(nèi)的12種真菌DNA甲基轉(zhuǎn)移酶氨基酸序列共聚成兩個群。其中與球孢白僵菌Dim-2基因編碼蛋白關(guān)系最近的蛹蟲草DIM-2蛋白，二者一致性達(dá)到了63％。
　　將本實驗室保存的球孢白僵菌Bb2005單孢株點接于SDAY培養(yǎng)基中，25℃下每十天傳代培養(yǎng)一次，并觀察菌體生長與產(chǎn)孢情況。菌落形態(tài)學(xué)檢測

6、發(fā)現(xiàn)，在1~3代時，白僵菌Bb2005菌落呈規(guī)則的圓形，5天后開始產(chǎn)孢，第7天形成大量孢子；而第4代培養(yǎng)時，菌體開始出現(xiàn)不規(guī)則的扇形角變區(qū)域，且產(chǎn)孢變少；培養(yǎng)至第10代時出現(xiàn)菌絲生長旺盛，產(chǎn)孢明顯減少的狀態(tài)；而培養(yǎng)至第25代時白僵菌Bb2005已完全退化，菌絲瘋長且很少產(chǎn)孢。
　　利用Realtime-PCR與HPLC技術(shù)分別對第1代、第25代和復(fù)壯后的球孢白僵菌Bb2005菌株在第3、5、7、10、15天培養(yǎng)時的Dim-2基因轉(zhuǎn)

7、錄表達(dá)量和基因組DNA的5-甲基胞嘧啶百分含量進(jìn)行檢測。檢測發(fā)現(xiàn)，白僵菌Bb2005菌株不同代數(shù)與不同生長階段，其DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)與DNA甲基化程度均有差異。球孢白僵菌DNA甲基化程度會隨著其生長發(fā)育的變化而不斷改變，并且DNA甲基化與球孢白僵菌Dim-2的表達(dá)具有一定的相關(guān)性。結(jié)果還顯示，球孢白僵菌Dim-2基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量與基因組DNA的5-甲基胞嘧啶百分含量在菌體生長過程中，均呈現(xiàn)兩邊高中間低的趨勢。在菌體培養(yǎng)初始產(chǎn)孢階段，