人外周血、臍血、脂肪組織中內(nèi)皮祖細胞生物特性比較研究.pdf

1、目的：內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPC)是血管內(nèi)皮前體細胞，存在于外周血、骨髓、臍血中，具有胚胎性成血管特性，參與缺血性疾病血管新生。隨著對EPC的深入研究，發(fā)現(xiàn)脂肪間充質(zhì)干細胞在一定條件下可分化成內(nèi)皮祖細胞，促進缺血區(qū)域血管生成。脂肪組織在體內(nèi)含量豐富，較易獲取，可能在自體干細胞移植治療缺血性疾病有較大應用前景。正常成人外周血EPC數(shù)量雖少，但外周血干細胞采集方便，自體移植無免疫排斥反應，因

2、而其臨床應用也較多。臍帶和胎盤是臍血EPC良好來源，采集容易，由于干細胞處于較幼稚階段，辨識“自我”與“非我”的能力較骨髓或外周血干細胞差，可能適用于同種異體干細胞移植。但這些研究多側(cè)重于獲取容易或理論推測，未進行系統(tǒng)的生物學特性比較研究。因此本實驗在于研究人外周血、臍血、脂肪組織三種不同來源內(nèi)皮祖細胞生物學特性異同，主要便于根據(jù)不同來源和特性的內(nèi)皮祖細胞，探討可能不同的適應范圍和方式與方法，提高內(nèi)皮祖細胞的應用效率。 方法：1

3、．采用密度梯度離心分離人外周血、臍血單個核細胞，胰蛋白酶消化提取脂肪干細胞。2．采集細胞用內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基M199(含20％胎牛血清，VEGF、bFGF)誘導分化內(nèi)皮祖細胞。3．倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。4．培養(yǎng)第7天的爬片細胞進行CD133免疫熒光檢測，激光共聚焦檢測攝取Dil-ac-LDL與吸附FITC-UEA-I雙染陽性細胞。5．培養(yǎng)7d貼壁細胞胰蛋白酶消化，低溫凍存2個月，復蘇后細胞部分行流式細胞儀檢測其CD34陽性率，部分采

4、用MTT法檢測細胞增殖，Boyden小室檢測遷移能力，貼壁法檢測細胞黏附功能以及血管生成試劑盒檢測細胞體外成血管能力。 結(jié)果：1.倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)：剛分離的人外周血、臍血單個核細胞呈圓形，細胞形態(tài)小，3-4d可見細胞貼壁，伸展拉長。7d后貼壁細胞梭形、紡錘形，形成多個細胞簇；剛分離的脂肪間充質(zhì)干細胞小圓形，24-48h可見細胞貼壁，梭形細胞出現(xiàn)較早，7d出現(xiàn)線樣排列結(jié)構(gòu)。2.熒光顯微鏡下觀察到CBMNCs、PBMNC

5、s、ADSCs誘導分化第7d細胞均可見綠色熒光，CD133陽性染色。3.激光共聚焦顯微鏡顯示CBMNCs、PBMNCs、ADSCs誘導分化第7d細胞出現(xiàn)橙黃色雙染陽性，說明細胞攝取Dil-ac-LDL與吸附FITC-UEA-I，證實其為正在分化的EPC。4.凍存復蘇后細胞流式細胞儀檢測CD34陽性細胞率，CBEPC、PBEPC、ADEPC分別為(72.74±4.6)％，(44.9±4.9)％，(48.7±5.3)％，臍血源性EPC明顯高

6、于后兩者(P<0.01)。5.MTT法檢測不同來源EPC增殖功能示CBEPC為(0.775±0.083)，PBEPC為(0.619±0.079)，ADEPC為(0.693±0.053)；前者與后兩者分別相比(P<0.05)。Boyden小室檢測遷移能力示，CBEPC為(53.53±10.46)，PBEPC為(37.70±9.83)，ADEPC為(34.04±12.72)；前者與后兩者分別相比(P<0.01)。貼壁法檢測細胞黏附功能示CB

7、EPC為(83.85±10.39)，PBEPC為(71.86±13.66)，ADEPC為(69.39±13.63)；前者與后兩者分別相比(P<0.05)。血管生成試劑盒檢測細胞體外成血管能力觀察到接種細胞拉長，成出芽式生長，形成管狀樹枝樣分叉結(jié)構(gòu)，形成小管情況：CBEPC為(93.09±12.04)，ADEPC為(77.74±6.86)(P<0.01)；PBEPC為(63.84±7.13)與ADEPC相比(P<0.01)。 結(jié)論