人臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞移植治療下肢缺血的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、【目的】
　　 本研究旨在從人臍帶血中培養(yǎng)和擴(kuò)增內(nèi)皮祖細(xì)胞，同時(shí)對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞活性進(jìn)行刺激，觀察移植擴(kuò)增處理后的內(nèi)皮祖細(xì)胞對(duì)缺血下肢的影響，為臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞移植治療下肢缺血性疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 【方法】
　　 1、取健康孕婦分娩后臍血，以密度梯度離心法分離臍血單個(gè)核細(xì)胞，接種于包被有人纖維連接蛋白的培養(yǎng)板中，2天后收集懸浮細(xì)胞重新貼壁培養(yǎng)到第7天，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，并對(duì)貼壁細(xì)胞通過(guò)免疫組化、免疫熒光和流式細(xì)胞

2、技術(shù)進(jìn)行鑒定，證明其為內(nèi)皮祖細(xì)胞。
　　 2、7天后消化收集內(nèi)皮祖細(xì)胞，將細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，加入24孔培養(yǎng)板，分別按照不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基種類（M199、EGM-2、DMEM）,不同細(xì)胞接種密度（1×103、1×104、1×105/cm2），不同胎牛血清濃度（5％、10％、20％）和不同細(xì)胞因子組合（VEGF、VEGF+bFGF、VEGF+bFGF+EPO）等條件進(jìn)行培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)按L9（34）正交設(shè)計(jì)分組。7天后計(jì)算細(xì)胞個(gè)數(shù)，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞擴(kuò)

3、增倍數(shù)，篩選出令細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)最多的培養(yǎng)條件，并對(duì)擴(kuò)增后的內(nèi)皮祖細(xì)胞進(jìn)行表面標(biāo)志、免疫熒光和血管形成功能鑒定。分別用10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml的SDF-1處理擴(kuò)增后的內(nèi)皮祖細(xì)胞，并設(shè)對(duì)照組，應(yīng)用改良的Boyden小室測(cè)定細(xì)胞的遷移能力，并測(cè)定細(xì)胞的黏附能力。
　　 3、建立缺血后肢動(dòng)物模型，隨機(jī)分4組,分別為局部移植EPCs（A組），擴(kuò)增后的EPCs+SDF-1（B組）、SDF-1（C組）和細(xì)胞培養(yǎng)液（D組）

4、，移植后進(jìn)行肢體缺血評(píng)估，觀察缺血裸鼠后肢皮膚色澤，檢測(cè)皮溫差，統(tǒng)計(jì)后肢保肢率，觀察缺血肌肉血管新生情況，分析擴(kuò)增處理內(nèi)皮祖細(xì)胞對(duì)移植效率的影響。
　　 【結(jié)果】
　　 1、臍血單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)第5天可見(jiàn)貼壁細(xì)胞呈集落樣生長(zhǎng)，10天后大多數(shù)細(xì)胞呈梭形，第21天可見(jiàn)鋪路石樣結(jié)構(gòu)。第7天的貼壁細(xì)胞吞噬DiI-acLDL后，在倒置顯微鏡下觀察呈紅色熒光；結(jié)合FITC-UEA-1后呈綠色熒光；雙染色陽(yáng)性細(xì)胞為黃色熒光，倒置顯微鏡下

5、計(jì)數(shù)雙染色陽(yáng)性細(xì)胞>75％。流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD34陽(yáng)性表達(dá)率為51.4％，CD133陽(yáng)性表達(dá)率為28.7％，VEGFR-2陽(yáng)性表達(dá)率為82.8％，F(xiàn)VIII因子陽(yáng)性率>80％。
　　 2、內(nèi)皮祖細(xì)胞經(jīng)各種條件培養(yǎng)后數(shù)量均有增加，各因素對(duì)擴(kuò)增細(xì)胞的作用為細(xì)胞因子>基礎(chǔ)培養(yǎng)基>胎牛濃度>接種密度，在接種密度為1×104/cm2，含5％的FBS及添加了細(xì)胞因子（VEGF+bFGF+EPO）的M199培養(yǎng)液里內(nèi)皮祖細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)最多，可達(dá)

6、80余倍。擴(kuò)增后的內(nèi)皮祖細(xì)胞CD34、CD133、VEGFR-2陽(yáng)性表達(dá)率為分別為41.6％、23.6％和88.3％，免疫熒光雙染色陽(yáng)性細(xì)胞>65％，Ⅷ因子陽(yáng)性表達(dá)率>85％。內(nèi)皮祖細(xì)胞在體外ECMatrixTM上孵育可以形成網(wǎng)狀血管樣結(jié)構(gòu)。內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)和粘附實(shí)驗(yàn)顯示，對(duì)照組、SDF-1濃度分別為l0ng/ml,50ng/ml,100ng/ml時(shí)，細(xì)胞遷移數(shù)分別為19.33±2.02個(gè)，29.33±1.45個(gè)，71.66±3.48

7、個(gè)和88.66±2.60個(gè)，細(xì)胞的粘附個(gè)數(shù)分別為29.3±1.52個(gè)，44.6±2.51個(gè)，74.6±2.51個(gè)和84.0±3.00個(gè)。SDF-1各濃度的細(xì)胞遷移數(shù)和粘附數(shù)與對(duì)照組比較均有顯著性差異(P＜0.05)，10ng/ml組與50ng/ml組、50ng/ml組與100ng/ml組相比較，P＜0.05。
　　 3、28天后，經(jīng)過(guò)處理的裸鼠后肢缺血評(píng)分平均為A組1.9分、B組1.4分、C組2.4分和D組2.5分；后肢保肢率為

8、A組40％、B組保肢率為60％、C組保肢率為20％、D組保肢率為20％；術(shù)后14 d、28 d，缺血裸鼠后肢皮溫差A(yù)組、B組較D組明顯減少（P＜0.05），B組較A組明顯減少（P＜0.05），均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；術(shù)后28 d，四組肌肉毛細(xì)血管密度分別為3.94±1.26、5.63±1.22、2.52±0.87、2.37±0.66，A組、B組毛細(xì)血管密度顯著大于D組（P＜0.05），B組大于A組（P＜0.05），均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而C組與D組

9、無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 【結(jié)論】
　　 1、通過(guò)體外擴(kuò)增的方法能從臍帶血中獲取足夠數(shù)量的內(nèi)皮祖細(xì)胞，內(nèi)皮祖細(xì)胞在接種密度為1×104/cm2，含5％的胎牛血清及添加了細(xì)胞因子VEGF+bFGF+EPO的M199培養(yǎng)液里擴(kuò)增倍數(shù)最多；
　　 2、SDF-1增加內(nèi)皮祖細(xì)胞的遷移和粘附能力并具有劑量依賴性，在體內(nèi)促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞歸巢；
　　 3、內(nèi)皮祖細(xì)胞能通過(guò)增加裸鼠缺血后肢的血管密度來(lái)改善下肢缺血的癥狀；<