人臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞糖基化修飾及其在骨折修復(fù)中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、第一部分人臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞糖基化修飾在缺血修復(fù)中的應(yīng)用
　　目的:血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells, EPCs)用于缺血性疾病治療最關(guān)鍵的是干細(xì)胞必須定向歸巢到缺血壞死組織,而細(xì)胞歸巢的第一步就是EPCs表達(dá)的P-選擇素糖蛋白配體(P-selectin glycoprotein, PSGL-1)與P-選擇素、E-選擇素的結(jié)合完成的。天然的EPCs的PSGL-1末端缺乏巖藻糖化的O-糖結(jié)構(gòu)(si

2、alyl Lewisx,sLex)。我們通過體外質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)行糖基化修飾,探討 EPCs糖基化修飾后對其定向歸巢到缺血組織能力的影響,以及對其生成血管能力的影響,為進(jìn)一步應(yīng)用于臨床治療提供依據(jù)。
　　方法:
　　(1)收集健康產(chǎn)婦臍血,采用密度梯度離心法分離單核細(xì)胞層,CD34免疫磁珠法獲取原代EPCs,使用纖維連接蛋白處理的培養(yǎng)板、內(nèi)皮特異性培養(yǎng)液,形成內(nèi)皮細(xì)胞克隆進(jìn)行傳代。
　　(2)利用流式細(xì)胞儀、免疫熒光分析EP

3、Cs表面標(biāo)記分子的表達(dá),檢測細(xì)胞攝取DiI-AcLDL的能力及體外成血管能力。
　　(3)通過蛋白印跡實(shí)驗(yàn)(Western blot)鑒定EPCs體外糖基化修飾,流式細(xì)胞儀檢測s L e x的表達(dá), EPCs與 P-選擇素、E-選擇素的結(jié)合能力。
　　(4)通過腫瘤壞死因子α刺激臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)模擬體內(nèi)炎癥反應(yīng)過程,檢測EPCs與HUVEC的粘附,評估糖基化修飾對EPCs與HUVEC粘附能力的影響。
　　(

4、5)建立免疫缺陷小鼠下肢缺血模型,尾靜脈注射EPCs,通過免疫熒光方法檢測糖基化修飾對細(xì)胞定向歸巢能力的影響,缺血端新生血管的形成情況,并定量分析。
　　(6)利用激光多普勒血流成像儀(Laser Doppler perfusion imaging, LDPI)缺血端血流,評估缺血恢復(fù)情況。
　　結(jié)果:
　　(1)通過密度梯度離心法和免疫磁珠法篩從臍血中篩選出CD34+細(xì)胞,接種于FN包被的培養(yǎng)皿中。接種5天后可見細(xì)胞

5、呈“鋪路石樣”生長。
　　(2)對EPCs進(jìn)行鑒定:流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示,CD34、CD133、CD31、CD105、CD144、CD146和VEGFR2的表達(dá)均為陽性,CD14及CD45的表達(dá)為陰性;免疫熒光染色EPCs細(xì)胞表面CD31、CD144、VWF陽性;將EPCs與D i I-A c L D L共孵育,熒光顯微鏡下觀察到EPCs具有攝取D i I-A c L D L的能力;將細(xì)胞加至Matrigel基質(zhì)膠上,培養(yǎng)3 h后,

6、可觀測到血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)形成,顯示EPCs具有成血管能力。
　　(3)用人巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(α1,3-fucosyltransferaseⅥ, FucT VI)構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染EPCs,Western blot檢測到重組人巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶蛋白的表達(dá)。EPCs流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)糖基化修飾后FucT VI轉(zhuǎn)染組 s L e x的表達(dá)明顯高于空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組;FucT VI轉(zhuǎn)染組 EPCs與P-選擇素、E-選擇素的結(jié)合能力也高于空載體對照組;糖基

7、化修飾組 EPCs與腫瘤壞死因子α刺激后的HUVEC的結(jié)合能力顯著提高,約為未糖基化組的2倍(p<0.01)。
　　(4)建立下肢缺血模型,尾靜脈注射EPCs,三天后收集缺血側(cè)肌肉組織,熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)熒光標(biāo)記的細(xì)胞數(shù),經(jīng)統(tǒng)計(jì)糖基化組的EPCs歸巢到局部的數(shù)目顯著高于未糖基化組(p<0.01)。
　　(5)建立下肢缺血模型術(shù)后2W時(shí),取缺血端組織冰凍切片,CD31標(biāo)記血管,共聚焦顯微鏡下采集圖像。EPCs糖基化組與未糖基化組

8、新生毛細(xì)血管顯著高于生理鹽水對照組(p<0.01),同時(shí)糖基化修飾的EPC新生血管能力遠(yuǎn)高于未糖基化組(p<0.01)。
　　(6)建立下肢缺血模型術(shù)后2W時(shí),采用LDPI檢測缺血側(cè)血流情況,結(jié)果顯示糖基化處理組較生理鹽水組升高90±6％,未糖基化處理組較生理鹽水組升高42±3％,三組之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)。
　　結(jié)論:
　　我們成功地從臍血中分離和培養(yǎng)了EPCs,研究發(fā)現(xiàn)臍血來源的EPCs存在PSG

9、L-1糖基化缺陷,通過體外糖基化修飾恢復(fù)了EPCs的PSGL-1功能后,經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)動物模型證實(shí)了糖基化修飾后EPCs具有促進(jìn)EPCs歸巢、缺血端血管生成的作用。為臍血來源的EPCs用于缺血性疾病的治療奠定了理論及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　第二部分人臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞糖基化修飾在骨折修復(fù)中的作用及機(jī)制研究
　　目的:骨折端血運(yùn)是影響骨折修復(fù)的關(guān)鍵因素之一。血供的不足常導(dǎo)致骨延遲愈合或者骨不愈合。近年來,血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)因其有

10、很強(qiáng)的成血管能力而被用于骨折修復(fù)的干細(xì)胞治療。我們前期研究發(fā)現(xiàn)EPCs體外糖基化修飾提高了其定向歸巢到缺血端組織的能力,增加了局部血管形成,促進(jìn)局部血流的恢復(fù)。本實(shí)驗(yàn)通過建立股骨骨折模型,探討EPCs糖基化修飾在骨折修復(fù)中的作用及相關(guān)機(jī)制研究,為以后在骨折治療中的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。
　　方法:
　　(1)免疫缺陷小鼠隨機(jī)分為三組:EPCs糖基化修飾組、未糖基化組、生理鹽水組,建立閉合型股骨骨折模型,將EPCs及生理鹽水行尾靜

11、脈注射,定期觀察相關(guān)指標(biāo)。
　　(2)通過免疫熒光方法檢測糖基化修飾對細(xì)胞定向歸巢能力的作用。
　　(3)通過RT-PCR技術(shù)對歸巢到骨折端的EPCs基因表達(dá)情況進(jìn)行分析。
　　(4)利用全組織染色方法,探究EPCs糖基化修飾后對骨折端骨膜血管再生的作用。
　　(5)利用LDPI評估骨折端血流的恢復(fù)情況。
　　(6)通過X線攝影及Micro-CT掃描骨痂,分析糖基化修飾對骨痂愈合的影響。
　　(7)對

12、骨痂切片行蕃紅O/固綠染色,觀察三組間骨痂結(jié)構(gòu)的差異。
　　結(jié)果:
　　(1)建立模型后2h,將經(jīng)DiI-Ac-LDL標(biāo)記EPCs或生理鹽水,通過尾靜脈注入體內(nèi),一周后收集骨折端組織,經(jīng)計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)糖基化組的EPCs歸巢到局部的數(shù)目明顯大于未糖基化組(76±6 vs.27±4 cells/mm2, p<0.001)。
　　(2)造模一周后取骨折端組織行RT-PCR,結(jié)果顯示生理鹽水組骨折端組織內(nèi)未見CD31、VE-Cad表

13、達(dá),而未糖基化組及糖基化組骨折端組織內(nèi)均有 CD31、V E-C a d等 EPCs相關(guān)基因的表達(dá)。
　　(3)用PECAM-1標(biāo)記骨痂表面的骨膜血管,術(shù)后2W時(shí)EPCs糖基化修飾組骨膜新生血管數(shù)顯著高于其它兩組(p<0.05)4 W時(shí) EPCs注射與生理鹽水組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05),糖基化組與未糖基化組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)。
　　(4)LDPI檢測骨折端血流,術(shù)后當(dāng)天三組間血流相對百分比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差

14、異(p>0.05),術(shù)后2W時(shí)糖基化修飾組血流灌注顯著高于其余兩組,三組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05)。
　　(5)通過X線片計(jì)算相對骨痂面積。術(shù)后2W時(shí)糖基化組與其余兩組相比,骨痂面積較大(p<0.05),術(shù)后4W時(shí)糖基化組明顯小于其它兩組(p<0.05)。術(shù)后6W時(shí)生理鹽水組與其他兩組相比,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05),術(shù)后8W時(shí)三組間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)。
　　(6)經(jīng)Micro-CT掃描,術(shù)后2W、4W

15、時(shí)糖基化組骨痂TV值顯著高于其它兩組(p<0.05),術(shù)后6 W時(shí) EPCs兩組間TV值相似,但是顯著大于生理鹽水組
　　(p<0.05),術(shù)后8W時(shí)三組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)。BV/TV值在骨折愈合過程中逐漸升高,糖基化組一直處于最高,同時(shí)未糖基化組顯著高于生理鹽水組(p<0.05)。
　　(7)組織學(xué)染色顯示,術(shù)后2W時(shí)生理鹽水組含有大量的軟骨細(xì)胞,糖基化修飾組含有大量的編織骨性組織與少量的軟骨細(xì)胞,未糖基化組介于