Compound3對(duì)人卵巢癌細(xì)胞SKOV3生長(zhǎng)抑制作用及凋亡作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：
　　 誘導(dǎo)惡性腫瘤細(xì)胞的凋亡和增強(qiáng)化療藥物的敏感性是治療卵巢癌的重要方向。細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡，包括兩種死亡途徑，即死亡受體途徑與線(xiàn)粒體途徑。死亡受體途徑又稱(chēng)外源性凋亡途徑，是通過(guò)死亡配體與其細(xì)胞膜上的相應(yīng)的受體結(jié)合，然后通過(guò)DISC的形成以激活caspase8/10，并最終激活caspase 3啟動(dòng)細(xì)胞凋亡。線(xiàn)粒體通路又稱(chēng)內(nèi)源性凋亡途徑，是線(xiàn)粒體接受外界凋亡刺激信號(hào)后釋放細(xì)胞色素C至細(xì)胞漿中，細(xì)胞色素C與凋

2、亡蛋白酶激活因子
　　 1、caspase9及ATP等相互作用導(dǎo)致凋亡小體的形成，進(jìn)而激活caspase 3從而誘發(fā)凋亡。
　　 Smac是一種線(xiàn)粒體蛋白，在凋亡刺激信號(hào)下，與細(xì)胞色素C一起自線(xiàn)粒體釋放入細(xì)胞胞漿內(nèi)，通過(guò)其N(xiāo)端的四個(gè)氨基酸殘基AVPI結(jié)構(gòu)域，與IAPs家族中的各個(gè)蛋白的BIR結(jié)構(gòu)域結(jié)合，而IAPs正是通過(guò)該結(jié)構(gòu)域與caspase家族結(jié)合以抑制caspase的凋亡作用，從而發(fā)揮抑制凋亡作用。因此，Smac蛋

3、白能夠使IAPs喪失與caspase的結(jié)合能力，促進(jìn)IAPs的降解，從而使caspase能夠發(fā)揮凋亡作用。IAPs是化療藥物促凋亡過(guò)程中的關(guān)鍵蛋白，決定了化療敏感性及耐受性，因此IAPs成為治療惡性腫瘤的新靶點(diǎn)，IAPs的抑制蛋白Smac蛋白也成為治療惡性腫瘤的新方法。為此，很多Smac蛋白的模擬物問(wèn)世。Smac蛋白的模擬物有多聚核苷酸，Smac多肽，Smac小分子三種。其中Smac小分子為一種小分子化合物，因其具有較強(qiáng)細(xì)胞膜穿透作用、

4、代謝周期長(zhǎng)、生物利用度較高等優(yōu)點(diǎn)而成為目前研究的熱點(diǎn)。
　　 2004年美國(guó)德克薩斯大學(xué)西南醫(yī)學(xué)中心根據(jù)Smac蛋白的N端功能結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)合成了一種具有Smac蛋白生物學(xué)活性的Smac蛋白模擬物，命名為Smac小分子compound 3。順鉑是卵巢癌治療的一線(xiàn)化療藥物之一，其主要作用機(jī)制是作用于DNA鏈間及鏈內(nèi)交鏈，能夠與DNA形成復(fù)合物從而干擾DNA的復(fù)制，并且能夠與核蛋白或者胞漿蛋白結(jié)合，損害細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，干擾細(xì)胞的生理功能，最

5、終引起細(xì)胞凋亡。
　　 研究目的：
　　 通過(guò)檢測(cè)compound 3與順鉑作用于人卵巢癌細(xì)胞SKOV3后的生長(zhǎng)抑制作用、細(xì)胞凋亡作用及XIAP、caspase3的表達(dá)，探討compound 3對(duì)人卵巢癌細(xì)胞SKOV3對(duì)順鉑的敏感性的影響。
　　 材料與方法：
　　 材料:人卵巢癌細(xì)胞SKOV3來(lái)源于上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。順鉑購(gòu)買(mǎi)于山東齊魯制藥公司。compound3為2004年美國(guó)德克薩斯大學(xué)西南醫(yī)學(xué)中

6、心實(shí)驗(yàn)室根據(jù)Smac蛋白的N端的氨基酸序列AVPI結(jié)構(gòu)域合成的一類(lèi)具有Smac蛋白生物學(xué)活性的小分子化合物。
　　 方法:人卵巢癌細(xì)胞SKOV3培養(yǎng)至細(xì)胞成對(duì)數(shù)生長(zhǎng)時(shí)，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組，如下:陰性對(duì)照組（培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)）、compound3組（compound3的應(yīng)用濃度為100nmol/L的濃度，是美國(guó)德克薩斯大學(xué)西南醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室推薦濃度）、順鉑組（順鉑的應(yīng)用濃度為4mg/L，是實(shí)驗(yàn)前通過(guò)進(jìn)行MTT測(cè)得的順鉑作用于人卵巢癌細(xì)胞S

7、KOV348h的LC50）、compound3+順鉑組（compound3的應(yīng)用濃度為100nmol/L的濃度，順鉑的應(yīng)用濃度為4mg/L）。MTT法檢測(cè)各組人卵巢癌細(xì)胞SKOV3的存活率、生長(zhǎng)抑制率并根據(jù)存活率繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)。AnnexinV-FITC/PI雙標(biāo)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)人卵巢癌細(xì)胞SKOV3的凋亡率。Westernblot蛋白印跡檢測(cè)人卵巢癌細(xì)胞SKOV3的XIAP、caspase3的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1

8、.compound3對(duì)人卵巢癌細(xì)胞SKOV3的存活率的影響及繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn):順鉑作用于人卵巢癌細(xì)胞SKOV312、24、48h后的存活率分別為(96.38±2.0)％、(88.50±1.38)％、(45.78±0.66)％。compound3作用于SKOV312、24、48h后的存活率分別為(98.67±0.88)％、(89.88±0.39)％、(64.18±0.92)％。compound3+順鉑作用于SKOV312、24、48h后的存活

9、率分別為(92.2±0.99)％、(53.59±1.17)％、(25.56±0.6)％。Compoud3、順鉑均能使SKOV3的存活率降低。compound3+順鉑作用于SKOV312、24、48h后存活率降低較順鉑及compound3作用于SKOV3后的存活率降低更加明顯。根據(jù)存活率繪制的生長(zhǎng)曲線(xiàn)顯示三組存活率均隨作用時(shí)間延長(zhǎng)而降低，具有時(shí)間依賴(lài)性。
　　 2.compound3對(duì)人卵巢癌細(xì)胞SKOV3的生長(zhǎng)抑制作用:comp

10、ound3+順鉑、順鉑作用于SKOV324h后的生長(zhǎng)抑制率分別為(46.4±1.17)％、(11.5±1.38)％;48h后的生長(zhǎng)抑制率分別為(74.03±0.6)％、(54.22±0.66)％。compound3+順鉑作用于SKOV324、48h后的生長(zhǎng)抑制率比順鉑作用于SKOV324、48h后的生長(zhǎng)抑制率均明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Compound3能夠增強(qiáng)順鉑對(duì)人卵巢癌細(xì)胞SKOV3的生長(zhǎng)抑制作用。
　　 3.comp

11、ound3對(duì)人卵巢癌細(xì)胞SKOV3的細(xì)胞凋亡作用:compound3+順鉑作用于SKOV324h后的凋亡率為(28.32±1.09)％;順鉑、compound3作用于SKOV324h的凋亡率分別為(20.8±2.09)％、(19.44±1.89)％。compound3+順鉑作用于SKOV348h后的凋亡率為(84.48±0.98)％;順鉑、compound3作用于SKOV348h后的凋亡率分別為(54.4±1.32)％、(23.59±2

12、.04)％。compound3+順鉑作用于SKOV324、48h的凋亡率均明顯高于順鉑及compound3作用于SKOV324、48h的凋亡率，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Compound3能夠促進(jìn)順鉑對(duì)卵巢癌細(xì)胞SKOV3的細(xì)胞凋亡作用。
　　 4.compound3對(duì)人卵巢癌細(xì)胞SKOV3的XIAP及caspase-3的表達(dá)的影響:compound3+順鉑作用于卵巢癌細(xì)胞SKOV324、48h后，測(cè)得XIAP的表達(dá)逐漸減低，并存在時(shí)

13、間依賴(lài)關(guān)系。compound3及compound3+順鉑作用于SKOV324、48h后XIAP表達(dá)均降低。compound3+順鉑作用于SKOV324、48h后的caspase3的激活片段與順鉑、compound3作用與SKOV324、48h后的caspase3的激活片段相比，表達(dá)明顯增高。Compound3能夠使XIAP表達(dá)降低，聯(lián)合順鉑應(yīng)用時(shí)能夠使caspase3激活片段表達(dá)升高。
　　 結(jié)論及意義：
　　 1.co