豬瘟病毒Npro蛋白和宿主豬IRF-1蛋白多克隆抗體制備及其相關(guān)性初步探索.pdf

1、豬瘟是由豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起的一種高接觸傳染性致死性的豬傳染病，以出血和高熱為特征，感染的豬群常常大量死亡，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。CSFV屬于黃病毒科、瘟病毒屬，是一種單股正鏈RNA病毒。Npro非結(jié)構(gòu)蛋白是CSFV基因組首先翻譯出來的蛋白質(zhì)，具有CSFV自體蛋白酶活性，斷裂后催化多聚蛋白成為12種成熟的病毒蛋白。Npro能夠抑制IFN-α/β轉(zhuǎn)錄的干擾素調(diào)節(jié)因子3(Interf

2、eron regulatory factor3，IRF3)，具有阻礙IFN-α/β誘導(dǎo)的作用。干擾素調(diào)節(jié)因子1(Interferon regulatoryfactor1，IRF1)是一個重要的多功能轉(zhuǎn)錄因子。這個轉(zhuǎn)錄因子家族具有調(diào)節(jié)干擾素表達(dá)、抗病毒、抗腫瘤等多種作用。并且，IRF1還選擇性地調(diào)節(jié)不同基因在不同細(xì)胞中的免疫應(yīng)答效應(yīng)。本研究在先前的工作基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探索Npro與IRF1的相互作用關(guān)系，但目前尚沒有良好的抗Npro和抗IR

3、F1的抗體商品銷售，因此要先研制豬瘟病毒Npro蛋白的抗體，以便對豬瘟病毒蛋白的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行進(jìn)一步的探討;而制備所得的IRF-1抗體，可以為研究CSFV感染時，IRF1與干擾素、干擾素刺激應(yīng)答基因(Inierferon stimulatedgenes，ISG)等各種免疫應(yīng)答因子的相關(guān)關(guān)系打下基礎(chǔ)。
　　首先擴(kuò)增了豬瘟病毒基因組編碼Npro蛋白基因片段和豬IRF-1基因，克隆到pMD18-T載體，再亞克隆到原核表達(dá)載體pET-32

4、α(+)上，成功構(gòu)建了重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET-Npro和pET-IRF-1。將pET-Npro、pET-IRF-1分別轉(zhuǎn)到大腸桿菌Rosetta中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)的蛋白產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE和Western blot檢測，證實了Npro基因和IRF-1基因得到了有效的表達(dá)。Npro蛋白以包涵體和可溶性蛋白兩種形式表達(dá)，而IRF-1主要是以可溶性蛋白形式表達(dá)。本文對Npro和IRF-1的可溶性蛋白利用鎳離子(Ni+)親和層析的方

5、法進(jìn)行純化，將純化所得到的Npro和IRF-1的活性蛋白作為抗原，分別按免疫程序免疫4周齡的小鼠，制備這兩種蛋白的多克隆抗體。結(jié)果顯示，制備的抗Npro和抗IRF-1的小鼠血清，經(jīng)用Western blot檢測，抗Npro和抗IRF-1的多克隆抗體，兩者能夠分別和原核表達(dá)重組蛋白Npro和IRF-1發(fā)生良好的反應(yīng)。進(jìn)一步檢測多克隆抗體的特異性，Npro蛋白的多克隆抗體能夠與天然構(gòu)象的豬瘟病毒Npro結(jié)合。PK-15細(xì)胞感染豬瘟病毒后，用

6、IRF-1多克隆抗體可檢測到IRF-1蛋白表達(dá)的變化，并且細(xì)胞感染豬瘟病毒后48 h能檢測出IRF-1的表達(dá)量較高，同時，Npro蛋白的多克隆抗體能夠特異性地識別PK-15細(xì)胞中真核表達(dá)的Npro蛋白。兩種抗體的最適稀釋度為1∶2000，證明以上所制備的兩個多克隆抗體具有良好的特異性和反應(yīng)性。
　　通過制備的抗體，運(yùn)用實時熒光定量PCR、Western blot技術(shù)檢測感染豬瘟病毒后PK-15細(xì)胞IRF-1的變化，發(fā)現(xiàn)IRF-1