ISG15的原核表達(dá)和多克隆抗體的制備及其與豬瘟病毒相互作用的初步研究.pdf

1、豬瘟病毒是豬烈性傳染病豬瘟的病原，屬于黃病毒科瘟病毒屬，是一種單股正鏈的RNA病毒，能夠在感染的豬體內(nèi)引起持續(xù)性感染。ISG15是一種由Ⅰ型干擾素誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的抗病毒蛋白，研究表明ISG15對(duì)一些病毒如人免疫缺陷病毒(HIV-1)、B型流感病毒等具有抗病毒作用。本實(shí)驗(yàn)室使用基因芯片技術(shù)檢測(cè)豬瘟病毒感染豬只的外周血單個(gè)核細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄譜的研究中，發(fā)現(xiàn)豬瘟病毒感染豬后1、3、6、9天采集的外周血淋巴細(xì)胞中ISG15基因mRNA分別呈2.63

2、、4.51、4.43、2.18倍的變化。本研究的目的是為了進(jìn)一步在蛋白水平上驗(yàn)證感染豬瘟病毒后細(xì)胞ISG15的表達(dá)變化，并探討在宿主細(xì)胞中ISG15與豬瘟病毒之間的相互關(guān)系，為進(jìn)一步探索豬瘟病毒的持續(xù)性感染的分子機(jī)制打下基礎(chǔ)。
　　 本研究通過重組人I型干擾素IFNα-2b誘導(dǎo)PK-15細(xì)胞轉(zhuǎn)錄干擾素刺激基因，RT-PCR方法擴(kuò)增ISG15基因，并克隆至pMD18-T載體上，再將ISG15基因亞克隆至原核表達(dá)載體pGEX-4T-

3、1與真核表達(dá)載體pCDNA3.0。重組原核表達(dá)載體pGEX-ISG15轉(zhuǎn)化BL21菌株，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)ISG15重組蛋白，經(jīng)過Ni-NTA樹脂純化重組蛋白，將純化的ISG15重組蛋白與弗氏佐劑乳化免疫小鼠，制備ISG15多克隆抗體。重組真核表達(dá)載體pCDNA-ISG15用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，用新霉素類抗生素G418篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)ISG15蛋白的PK-15細(xì)胞系。
　　 通過制備的ISG15多克隆抗體，用間接免