豬ISG43和ISG60蛋白的原核表達(dá)及多克隆抗體制備.pdf

1、ISG60屬于IFIT家族成員，是一類干擾素誘導(dǎo)基因，在進化上高度保守。在干擾素、病毒、脂多糖等條件的刺激下，ISG60基因高效表達(dá)，主要作用于翻譯的起始、病毒的復(fù)制、Ⅰ型干擾素的反饋調(diào)節(jié)、細(xì)胞的遷移和增殖等。
　　ISG43于1999年首次被Liu等發(fā)現(xiàn)并報道其去泛素化功能，又稱為UBP43，是泛素特異性蛋白酶(UBP)家族成員。2002年，Malakhov等首次發(fā)現(xiàn)UBP43的去ISG化ISGylation功能，部分缺失UBP

2、43基因的細(xì)胞會發(fā)生干擾素過敏導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，由此可見ISG43是維持ISG化動態(tài)平衡的關(guān)鍵。
　　本研究克隆了ISG60和ISG43基因，將這些基因連接到pMD18-T載體，測序正確后再用XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切法插入PET-32a(+)克隆位點，成功構(gòu)建了PET-ISG60和PET-ISG43重組原核表達(dá)質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Rosetta(DE3)衍生菌并用不同濃度的IPTG進行誘導(dǎo)，經(jīng)SDS-PAGE和Western-Blo

3、t分析顯示，ISG43在0.5mM IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)最好，ISG60在0.05mM IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)最好，ISG43和ISG60兩者的重組蛋白都能以包涵體和可溶性蛋白兩種形式進行表達(dá)。通過可溶性蛋白形式純化蛋白獲得有活性的免疫原，以純化的ISG43和ISG60重組活性蛋白作為抗原與弗式佐劑一起免疫小鼠。經(jīng)過四次免疫后獲得了反應(yīng)性和特異性較高的多克隆抗體。用Western Blot檢測，產(chǎn)生的抗體能與原核表達(dá)蛋白發(fā)生反應(yīng)，又能與PK-