程序性細(xì)胞死亡因子4對胰腺癌生長抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本文擬從誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的角度出發(fā)，闡明程序性細(xì)胞死亡因子4(Programmed Cell Death，PDCD4)誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，并進(jìn)一步探討對5-FU抗腫瘤作用的影響，為聯(lián)合應(yīng)用基因治療和化學(xué)療法治療胰腺癌，提供新的思路和方法。 研究方法： 1.應(yīng)用免疫組化S-P法和Western blotting法分別檢測69例人胰腺癌石蠟組織切片和8例冷凍保存的新鮮胰腺癌組織中PDCD4的表達(dá)水平，探討其與腫瘤的

2、分化程度、病理分期等臨床病理參數(shù)的關(guān)系。 2.應(yīng)用人胰腺癌細(xì)胞系PANC-1，轉(zhuǎn)染PDCD4表達(dá)質(zhì)粒p<'EGFP-N1>/PDCD4及空載體質(zhì)粒p<'EGFP-N2>，提取細(xì)胞質(zhì)蛋白，應(yīng)用Westem blotting法檢測PDCD4和細(xì)胞色素C(Cyt.C)表達(dá)。同時(shí)行DNAladder凝膠電泳分析，進(jìn)行凋亡檢測。 3.轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)到對數(shù)生長期，依次加入不同濃度的5-氟尿嘧啶(5-FU)，應(yīng)用MTT法進(jìn)行細(xì)胞生長抑制

3、實(shí)驗(yàn)，計(jì)算細(xì)胞存活率。同時(shí)應(yīng)用Hoechest 33342熒光染料染色，用熒光顯微鏡觀察，進(jìn)行凋亡計(jì)數(shù)。再提取細(xì)胞質(zhì)蛋白，應(yīng)用Western blotting法檢測細(xì)胞色素C(Cyt.C)表達(dá)水平。 研究結(jié)果： 1.estem印跡分析：Western印跡檢測8例配對胰腺癌及癌旁正常胰腺組織的PDCD4蛋白表達(dá)情況結(jié)果顯示，同癌旁正常胰腺組織相比，所有胰腺癌組織PDCD4蛋白表達(dá)均明顯減弱或缺失。 2.免疫組織化學(xué)

4、染色：在正常胰腺組織中，陽性細(xì)胞比例均在80％以上。在69例胰腺癌組織中，PDCD4表達(dá)明顯下降，且表達(dá)水平出現(xiàn)明顯差異。在不同分化程度胰腺癌組織之間PDCD4表達(dá)存在明顯差異，隨著分化程度下降，表達(dá)明顯下調(diào)。 3．Westem blotting檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞PDCD4和Cyt．C水平，結(jié)果示與對照組相比，轉(zhuǎn)染組表達(dá)明顯增高。 4.DNA ladder凝膠電泳分析，轉(zhuǎn)染組見典型的凋亡梯形帶，說明出現(xiàn)細(xì)胞凋亡。 5.

5、MTT法結(jié)果顯示，隨著5-FU濃度升高，PANC-1活細(xì)胞比率下降。與對照組相比，在相同濃度的5-FU作用下，轉(zhuǎn)染組活細(xì)胞比率明顯下降，出現(xiàn)明顯的細(xì)胞生長抑制。 6.凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示，隨著5-FU濃度升高，PANC-1凋亡細(xì)胞比率增高。與對照組相比，在相同濃度的5-FU作用下，轉(zhuǎn)染組凋亡細(xì)胞比率明顯增高。 7.Westem blotting檢測相同濃度作用下的5-Fu，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞質(zhì)蛋白的Cyt．C表達(dá)水平明顯高于對照組。