桿狀病毒介導(dǎo)的DNMTlsiRNA對(duì)人胰腺癌裸鼠移植瘤抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:觀察介導(dǎo)RNA干擾(RNAi)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)基因表達(dá)的桿狀病毒載體(Bac-si-DNMT1-D)作用人胰腺癌裸鼠移植瘤組織后胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡的情況及對(duì)裸鼠的毒副作用；檢測(cè)腫瘤細(xì)胞中DNMT1基因的表達(dá)和抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化的變化；初步探索運(yùn)用桿狀病毒介導(dǎo)的DNMT1siRNA治療胰腺癌的可行性及其分子機(jī)制。
　　 方法:1.建立人胰腺癌SW1990細(xì)胞裸鼠移植瘤模型,選取24只,隨機(jī)分為4組:生

2、理鹽水組、空載體組、低濃度病毒組及高濃度病毒組。隔天向瘤內(nèi)注射重組病毒或生理鹽水0.1ml,共8次,與此同時(shí)測(cè)量各組腫瘤體積變化。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行25天后處死裸鼠,采集移植瘤標(biāo)本,并測(cè)量移植瘤重量及體積,繪制移植瘤生長(zhǎng)曲線。2.裸鼠處死后收集裸鼠血清,檢測(cè)血清中天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、肌酐(Cr)及尿素氮(BUN)的含量。3.在無(wú)菌操作下采集裸鼠的心、肝、腎及移植瘤標(biāo)本,使用HE染色法觀察各組間標(biāo)本的病理變化。4.脫氧

3、核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記(TUNEL)法檢測(cè)桿狀病毒載體作用后各組裸鼠移植瘤細(xì)胞凋亡情況。5.實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-timePCR)檢測(cè)各組裸鼠移植瘤細(xì)胞中DNMT1mRNA的表達(dá)情況。6.免疫印跡法(Westernblot)檢測(cè)各組裸鼠移植瘤細(xì)胞中DNMT1、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病基因伴隨蛋白X(Bax)和B細(xì)胞淋巴瘤/白血病基因02(Bcl-2)的蛋白表達(dá)情況。7.甲基化特異性PCR(MSP)方法檢測(cè)各組裸鼠移

4、植瘤細(xì)胞中RAR-b、p16、GST-p、hMLH1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化情況。8.逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)檢測(cè)各組裸鼠移植瘤細(xì)胞中RAR-bmRNA表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:1.兩病毒組腫瘤生長(zhǎng)較對(duì)照組明顯被抑制；瘤重:空載體組(1.00±0.29)g、生理鹽水組(0.96±0.18)g、低濃度病毒組(0.54±0.35)g和高濃度病毒組(0.49+0.36)g。兩病毒組腫瘤瘤重小于兩對(duì)照組(P＜0.05)。2.各組荷瘤裸鼠的血

5、清檢測(cè)發(fā)現(xiàn)天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、肌酐(Cr)及尿素氮(BUN)的含量的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。3.光鏡下確認(rèn)所取組織為惡性腫瘤組織；鏡下心、肝及腎組織結(jié)構(gòu)正常,未見(jiàn)有炎癥、變性、壞死、細(xì)胞凋亡及轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞等。4.空載體組、生理鹽水組、低濃度病毒組和高濃度病毒組的凋亡指數(shù)分別為(16.4±8.5)%、(22.8±6.7)%、(49.3±4.6)%和(52.4±5.2)%,兩病毒組的凋亡率明顯高于空

6、載體組和生理鹽水組(P＜0.01),但兩病毒組間無(wú)明顯差異(P＞0.05)。5.實(shí)時(shí)熒光定量PCR示低濃度病毒組和高濃度病毒組腫瘤組織中DNMT1mRNA的表達(dá)量為(0.22±0.07)和(0.09±0.05),顯著低于生理鹽水組的(1.01±0.18)和空載體組(0.96±0.35,P＜0.01)。6.Westernblot結(jié)果示兩病毒組腫瘤組織中DNMT1及Bcl-2蛋白表達(dá)低于兩對(duì)照組,但Bax高于兩對(duì)照組(P＜0.05)。7.M

7、SP結(jié)果顯示DNMT1siRNA桿狀病毒干擾胰腺癌移植瘤后腫瘤細(xì)胞中RAR-b基因啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生去甲基化改變。8.RT-PCR結(jié)果與MSP檢測(cè)結(jié)果相對(duì)應(yīng),RNA干擾后腫瘤細(xì)胞內(nèi)RAR-b基因重新表達(dá)。
　　 結(jié)論:1.桿狀病毒介導(dǎo)的DNMT1siRNA載體在體內(nèi)可以有效抑制DNMT1基因的表達(dá)。2.桿狀病毒介導(dǎo)的DNMT1siRNA載體能促使胰腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡及生長(zhǎng)抑制,其機(jī)制可能與腫瘤細(xì)胞中RAR-b基因啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生去甲基化改變