柑橘中類黃酮新橘皮糖苷代謝關鍵基因分離和功能分析.pdf

1、柑橘風味中的苦味作為其重要的品質性狀而備受關注。類黃酮中的新橘皮糖苷類(Neohesperidoside;NEO)是影響柑橘果實前苦味(‘primary'bitterness)的主要物質，且其在柑橘果實中的代謝差異一直是近些年的研究熱點。柑橘種屬關系復雜、突變材料和種質資源多樣，豐富的次生代謝差異性使其成為研究類黃酮的理想材料。因此，從生理和分子水平上對柑橘進行種質資源評價以及苦味形成機理進行探討具有特殊優(yōu)勢且對產業(yè)發(fā)展意義重大。本研究

2、首先對種植廣泛但不積累NEO的甜橙果實組織進行類黃酮的定性和定量分析，初步研究甜橙中類黃酮的組成以及隨果實發(fā)育的含量變化;其次，克隆不同柑橘種質中調控NEO合成的J，2RhaT(1，2-rhamnosyltransferase gene)，分析該基因序列的多態(tài)性與不同種質中苦味品質產生的相關性，并利用自然群體和雜交群體提供更多遺傳學依據;最后，探索柚中與NEO代謝有直接競爭關系的代謝支路，利用基因轉化BY2煙草懸浮細胞系對1，2RhaT

3、-like蛋白dGlcT進行功能表征分析，且通過轉錄組以及基因表達定量分析數(shù)據闡明dGlcT和1，2RhaT在柑橘類黃酮代謝中的競爭作用。主要研究結果如下:
　　1.以兩個紅肉甜橙（‘紅肉’和‘紅暗柳’）和兩個普通果肉甜橙（‘清家’和‘暗柳’）不同發(fā)育期果實四個組織（黃皮層、白皮層、囊衣和汁胞）為材料，通過液相色譜-質譜聯(lián)用(LC-MS)法結合添加內標實驗，初步鑒定了甜橙果實各組織中黃烷酮糖苷和聚甲氧基黃酮的組成，并利用液相色譜(

4、HPLC)法進行定量分析。結果顯示，甜橙各組織中所檢測的四種黃烷酮糖苷類均屬于蕓香糖苷類(Rutinoside;RUT)，與NEO的前體物質相同，但并不具有苦味，表明甜橙在NEO代謝上并沒有遺傳柚的性狀;對甜橙中Csl，2RhaT-like基因進行克隆分析，發(fā)現(xiàn)一條與Cml，2RhaT（GenBank accession:AY048882）核苷酸序列同源性為92％的候選基因，但其編碼區(qū)出現(xiàn)兩處單堿基缺失，此基因的移碼突變可能是導致甜橙中

5、類黃酮NEO無法合成的直接原因。
　　2.對柑橘各種屬不同栽培種中1，2RhaT基因及其高度同源序列進行克隆，并結合柑橘基因組數(shù)據庫進行比對分析，發(fā)現(xiàn)柑橘基因組中擁有兩類與Cml，2RhaT高度同源且被注釋作為1，2RhaT-like的基因。一類具有豐富的序列多態(tài)性（命名為dGlcT-1），其編碼的氨基酸序列與Cm1，2RhaT同源性高達88％，且僅在個別柚種質中能擴增到完整的編碼區(qū)序列;另一類則包括兩個基因（命名為dGlcT-2

6、和dGlcT-3），其編碼的氨基酸序列與Cm1，2RhaT同源性均為67％，且以串聯(lián)復制的方式廣泛分布在各柑橘種質的基因組中。
　　3.對分屬柑橘屬、枳屬和金柑屬的50個柑橘栽培種進行1，2RhaT及1，2RhaT-like（dGlcT-1，dGlcT-2和dGlcT-3）基因型與柚皮苷積累表現(xiàn)型的關聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)僅J，2RhaT與枳屬和柑橘屬果實中柚皮苷的積累直接相關。此外，通過紅橘×枳殼以及HB柚×Fairchild雜交群體分析

7、表明，含完整1，2RhaT序列的雜交子代（對比Cm1,2RhaT，AY048882;NCBI）果實能正常合成柚皮苷，相反則不能，進一步證明1，2RhaT對柑橘屬和枳屬中柚皮苷的合成具有重要作用。值得關注的是，盡管具有完整的1，2RhaT序列，但金柑屬各種質中依然無法積累柚皮苷或者黃烷酮糖苷類，且將鳳凰柚中的Cm1，2RhaT轉化山金柑后依然無法檢測到柚皮苷的產生，預示著金柑屬中橘皮糖苷類的代謝缺失并非由1，2RhaT所致。
　　4

8、。研究結果同時表明，1，2RhaT-like基因與柑橘中NEO的產生并無直接關聯(lián)性。因此，通過基因轉化煙草BY2懸浮細胞體系對CmdGlcT-1，CsdGlcT-2以及Cm1，2RhaT進行了功能驗證及功能差異分析。結果顯示，dGlcT-1和dGlcT-2是一個底物廣泛的類黃酮-7-O-二-葡萄糖苷轉移酶，最優(yōu)底物是黃烷酮-7-O-葡萄糖苷;dGlcT不具有1，2RhaT功能且無法催化NEO的形成，但是其催化產物與類黃酮NEO可共用黃烷

9、酮/黃酮-7-O-葡萄糖苷作為直接前體，兩者間可能存在直接的底物競爭關系。但是，雖然有功能，dGlcT的代謝產物在果實整個發(fā)育期內含量均極低，轉錄組和基因表達定量分析結果表明在果實發(fā)育初期，NEO或者RUT對底物的強烈競爭導致其代謝受阻;隨著果實的成熟，流向類黃酮代謝底物的供應不足可能是類黃酮-7-O-二-葡萄糖苷乃至整個類黃酮糖苷類代謝受阻的主要原因。
　　通過對柑橘NEO特別是柚皮苷代謝積累機理的研究，為揭示柑橘前苦味形成機制