柑橘中類黃酮新橘皮糖苷代謝關(guān)鍵基因分離和功能分析.pdf

1、柑橘風(fēng)味中的苦味作為其重要的品質(zhì)性狀而備受關(guān)注。類黃酮中的新橘皮糖苷類(Neohesperidoside;NEO)是影響柑橘果實前苦味(‘primary'bitterness)的主要物質(zhì)，且其在柑橘果實中的代謝差異一直是近些年的研究熱點。柑橘種屬關(guān)系復(fù)雜、突變材料和種質(zhì)資源多樣，豐富的次生代謝差異性使其成為研究類黃酮的理想材料。因此，從生理和分子水平上對柑橘進(jìn)行種質(zhì)資源評價以及苦味形成機(jī)理進(jìn)行探討具有特殊優(yōu)勢且對產(chǎn)業(yè)發(fā)展意義重大。本研究

2、首先對種植廣泛但不積累NEO的甜橙果實組織進(jìn)行類黃酮的定性和定量分析，初步研究甜橙中類黃酮的組成以及隨果實發(fā)育的含量變化;其次，克隆不同柑橘種質(zhì)中調(diào)控NEO合成的J，2RhaT(1，2-rhamnosyltransferase gene)，分析該基因序列的多態(tài)性與不同種質(zhì)中苦味品質(zhì)產(chǎn)生的相關(guān)性，并利用自然群體和雜交群體提供更多遺傳學(xué)依據(jù);最后，探索柚中與NEO代謝有直接競爭關(guān)系的代謝支路，利用基因轉(zhuǎn)化BY2煙草懸浮細(xì)胞系對1，2RhaT

3、-like蛋白dGlcT進(jìn)行功能表征分析，且通過轉(zhuǎn)錄組以及基因表達(dá)定量分析數(shù)據(jù)闡明dGlcT和1，2RhaT在柑橘類黃酮代謝中的競爭作用。主要研究結(jié)果如下:
　　1.以兩個紅肉甜橙（‘紅肉’和‘紅暗柳’）和兩個普通果肉甜橙（‘清家’和‘暗柳’）不同發(fā)育期果實四個組織（黃皮層、白皮層、囊衣和汁胞）為材料，通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)法結(jié)合添加內(nèi)標(biāo)實驗，初步鑒定了甜橙果實各組織中黃烷酮糖苷和聚甲氧基黃酮的組成，并利用液相色譜(

4、HPLC)法進(jìn)行定量分析。結(jié)果顯示，甜橙各組織中所檢測的四種黃烷酮糖苷類均屬于蕓香糖苷類(Rutinoside;RUT)，與NEO的前體物質(zhì)相同，但并不具有苦味，表明甜橙在NEO代謝上并沒有遺傳柚的性狀;對甜橙中Csl，2RhaT-like基因進(jìn)行克隆分析，發(fā)現(xiàn)一條與Cml，2RhaT（GenBank accession:AY048882）核苷酸序列同源性為92％的候選基因，但其編碼區(qū)出現(xiàn)兩處單堿基缺失，此基因的移碼突變可能是導(dǎo)致甜橙中

5、類黃酮NEO無法合成的直接原因。
　　2.對柑橘各種屬不同栽培種中1，2RhaT基因及其高度同源序列進(jìn)行克隆，并結(jié)合柑橘基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析，發(fā)現(xiàn)柑橘基因組中擁有兩類與Cml，2RhaT高度同源且被注釋作為1，2RhaT-like的基因。一類具有豐富的序列多態(tài)性（命名為dGlcT-1），其編碼的氨基酸序列與Cm1，2RhaT同源性高達(dá)88％，且僅在個別柚種質(zhì)中能擴(kuò)增到完整的編碼區(qū)序列;另一類則包括兩個基因（命名為dGlcT-2

6、和dGlcT-3），其編碼的氨基酸序列與Cm1，2RhaT同源性均為67％，且以串聯(lián)復(fù)制的方式廣泛分布在各柑橘種質(zhì)的基因組中。
　　3.對分屬柑橘屬、枳屬和金柑屬的50個柑橘栽培種進(jìn)行1，2RhaT及1，2RhaT-like（dGlcT-1，dGlcT-2和dGlcT-3）基因型與柚皮苷積累表現(xiàn)型的關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)僅J，2RhaT與枳屬和柑橘屬果實中柚皮苷的積累直接相關(guān)。此外，通過紅橘×枳殼以及HB柚×Fairchild雜交群體分析

7、表明，含完整1，2RhaT序列的雜交子代（對比Cm1,2RhaT，AY048882;NCBI）果實能正常合成柚皮苷，相反則不能，進(jìn)一步證明1，2RhaT對柑橘屬和枳屬中柚皮苷的合成具有重要作用。值得關(guān)注的是，盡管具有完整的1，2RhaT序列，但金柑屬各種質(zhì)中依然無法積累柚皮苷或者黃烷酮糖苷類，且將鳳凰柚中的Cm1，2RhaT轉(zhuǎn)化山金柑后依然無法檢測到柚皮苷的產(chǎn)生，預(yù)示著金柑屬中橘皮糖苷類的代謝缺失并非由1，2RhaT所致。
　　4

8、。研究結(jié)果同時表明，1，2RhaT-like基因與柑橘中NEO的產(chǎn)生并無直接關(guān)聯(lián)性。因此，通過基因轉(zhuǎn)化煙草BY2懸浮細(xì)胞體系對CmdGlcT-1，CsdGlcT-2以及Cm1，2RhaT進(jìn)行了功能驗證及功能差異分析。結(jié)果顯示，dGlcT-1和dGlcT-2是一個底物廣泛的類黃酮-7-O-二-葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶，最優(yōu)底物是黃烷酮-7-O-葡萄糖苷;dGlcT不具有1，2RhaT功能且無法催化NEO的形成，但是其催化產(chǎn)物與類黃酮NEO可共用黃烷

9、酮/黃酮-7-O-葡萄糖苷作為直接前體，兩者間可能存在直接的底物競爭關(guān)系。但是，雖然有功能，dGlcT的代謝產(chǎn)物在果實整個發(fā)育期內(nèi)含量均極低，轉(zhuǎn)錄組和基因表達(dá)定量分析結(jié)果表明在果實發(fā)育初期，NEO或者RUT對底物的強(qiáng)烈競爭導(dǎo)致其代謝受阻;隨著果實的成熟，流向類黃酮代謝底物的供應(yīng)不足可能是類黃酮-7-O-二-葡萄糖苷乃至整個類黃酮糖苷類代謝受阻的主要原因。
　　通過對柑橘NEO特別是柚皮苷代謝積累機(jī)理的研究，為揭示柑橘前苦味形成機(jī)制