類黃酮3，5羥基化酶基因的克隆及其轉(zhuǎn)化菊花的初步研究.pdf

1、目前，在花色基因工程育種中，藍(lán)色花卉因其色彩高雅、稀少而成為研究的重點(diǎn)。其中，翠雀素衍生的花色素苷的積累被認(rèn)為是產(chǎn)生藍(lán)色花的三個(gè)必備條件之一。因此向非藍(lán)色花植物中引入編碼翠雀素的關(guān)鍵基因成為培育藍(lán)色花卉品種的一個(gè)重要手段。 類黃酮3，5羥基化酶(flavonoid-3’，5’-hydoxylase：F3’5’H)被認(rèn)為是合成翠雀素糖苷的關(guān)鍵酶。大多數(shù)天然藍(lán)色花是由于F3’5’H基因的有效表達(dá)，通過導(dǎo)入外源基因?yàn)樗{(lán)色花的培育提供了

2、可能性。本研究根據(jù)基因庫登陸F3’5’H序列設(shè)計(jì)特異引物，從瓜葉菊中擴(kuò)增F3’5’H基因，RT-PCR擴(kuò)增得到大約1500bp大小的特異片斷，將其克隆到載體pMD18-T。經(jīng)菌落PCR和酶切檢測并測序，確認(rèn)得到了類黃酮3，5羥基化酶(F3’5’H)基因。 查爾酮合成酶基因(Chalconesynthase；CHS)是植物體類黃酮合成的關(guān)鍵基因。CHS啟動(dòng)子具有很強(qiáng)的花瓣特異表達(dá)特性，在花卉的花色基因工程育種中有著重要的應(yīng)用價(jià)值。

3、本實(shí)驗(yàn)用改良SDS法提取矮牽牛的DNA，根據(jù)基因庫中PchsA登陸序列設(shè)計(jì)特異引物，從矮牽牛DNA中擴(kuò)增PchsA啟動(dòng)子。測序結(jié)果經(jīng)比對(duì)分析，可以確認(rèn)得到了啟動(dòng)子PchsA。 利用PCR方法將F3’5’H基因與啟動(dòng)子PchsA從pMD18-T載體上克隆下來，再將兩個(gè)片斷連接后再連入植物表達(dá)載體pBI12l。用pBI12l轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404。 建立菊花的轉(zhuǎn)化體系：OD值為0.5左右的農(nóng)桿菌菌液，浸染時(shí)間為7min,共