基于體內(nèi)過程的蒲黃—五靈脂藥對功效物質(zhì)基礎(chǔ)研究.pdf

1、蒲黃-五靈脂藥對始載于《證類本草》卷二十二引《近效方》，稱為失笑散，是由蒲黃、五靈脂兩味中藥組成，具有活血化瘀消結(jié)止痛的功效。主治瘀血停滯癥;心腹刺痛，產(chǎn)后惡露不行，或月經(jīng)不調(diào)，少腹急痛等。蒲黃-五靈脂藥對為治療瘀血疼痛的常用方，臨床上主要用于治療由于血瘀癥引起的相關(guān)病癥，在婦科疾病中療效尤其顯著?，F(xiàn)代研究表明，蒲黃—五靈脂藥對的有效成分主要有甾類、黃酮、多糖、有機酸、萜類、氨基酸、揮發(fā)油等，并具有安神、止痛、抗血小板聚集、抗動脈粥樣硬

2、化等藥理作用。本論文以蒲黃—五靈脂藥對為研究切入點，對蒲黃-五靈脂效應(yīng)物質(zhì)群在動物體內(nèi)過程進行研究，針對其效應(yīng)成分群、藥代動力學(xué)和組織分布特征、動物體內(nèi)的代謝產(chǎn)物鑒定與分析以及效應(yīng)成分群對ADP誘導(dǎo)的血小板聚集和抗凝血作用等方面開展研究工作，以探討其體內(nèi)直接藥效物質(zhì)與作用機制，為了進一步研究它的作用機理和其治療疾病的物質(zhì)基礎(chǔ)，揭示其臨床治療疾病的作用機理提供科學(xué)依據(jù)。為臨床合理用藥提供一定參考。全文主要研究內(nèi)容和結(jié)論如下:
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3、.蒲黃-五靈脂藥對配伍前后效應(yīng)成分群的高效液相色譜—二極管陣列檢測器(HPLC-PDA)分析。采用HPLC-PDA法同時分析測定樣品中沒食子酸、原兒茶酸、香草酸、對香豆酸、香蒲新苷和異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷的含量，結(jié)果表明，蒲黃、五靈脂配伍后香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷溶出增加，均高于蒲黃單煎液和單煎混合液;而沒食子酸、原兒茶酸、香草酸、對香豆酸4個有機酸類成分經(jīng)配伍后溶出量低于單煎液，但高于單煎混合液。以評價蒲黃-五靈脂

4、配伍前后化學(xué)成分的溶出變化為進一步體內(nèi)過程研究提供方法參考。
　　2.超高液相色譜飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜儀(UPLC-QTOF-MS-Markerlynx)聯(lián)用技術(shù)分析蒲黃-五靈脂藥對效應(yīng)成分群。應(yīng)用UPLC-QTOF-MS-Markerlynx聯(lián)用技術(shù)及主成分分析法(PCA)和正交偏最小二乘判別法進行數(shù)據(jù)分析，對蒲黃五靈脂合煎液、合并液中的主要化學(xué)成分進行分析，追蹤煎煮過程化學(xué)成分的變化，從化學(xué)成分變化的角度闡述二者配伍的科學(xué)內(nèi)涵。結(jié)

5、果表明，蒲黃-五靈脂配伍分煎混合液與合煎液總離子流色譜峰存在顯著差異，對有變化的碎片離子峰進行分析鑒定，共鑒定出5具有顯著差異的化合物，分別為香蒲新苷、柚皮素、異鼠李素-3-O-蕓香糖苷，槲皮素-3-O-新橙皮糖苷，山柰酚-3-O-新橙皮糖苷。提示經(jīng)合煎后可能會促進該藥對中的黃酮類成分的溶出。存在較大差異的色譜峰尚包括五靈脂中的成分，其化學(xué)結(jié)構(gòu)的確認尚需進一步研究。
　　3.蒲黃五靈脂藥對主要效應(yīng)成分群的藥代動力學(xué)研究及組織分布特

6、征分析。采用超高效液相色譜串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜法(UPLC-TQ/MS)建立了同時測定蒲黃五靈脂水提取物中對香豆酸、香草酸和香蒲新苷3種主要成分在血漿中的定量分析方法，該方法具有高選擇性、高靈敏度、精密準(zhǔn)確。藥動學(xué)結(jié)果說明，單味藥蒲黃組中香草酸、對香豆酸Cmax、AUCOT低于蒲黃-五靈脂合煎組(P＜0.05)，說明兩藥合用后吸收程度提高。同時單味藥Tmax與藥對組比顯著縮短(P＜0.05)，說明蒲黃五靈脂合用后香草酸、香蒲新苷吸收速率增

7、大、消除速率均變慢從而延長藥效。結(jié)果表明蒲黃-五靈脂藥對配伍前后有機酸類和黃酮類成分等效應(yīng)物質(zhì)的藥動學(xué)特征，其差異性可為藥對配伍合理性研究提供相關(guān)物質(zhì)基礎(chǔ)藥動學(xué)研究提供了可以借鑒的方法。組織分布結(jié)果顯示，對香豆酸在大鼠體內(nèi)分布主要集中于肝臟、脾臟及肺部，香草酸、香蒲新苷主要分布于肝臟、腎臟與肺部。三種成分主要分布于血供豐富的臟器，在胸腺等血流不豐富的臟器中幾乎不分布，且因其極性較大，較難通過血腦屏障，因此腦中幾乎檢測不到。蒲黃、五靈脂配

8、伍可顯著促進對香豆酸、香草酸和香蒲新苷在心、肝、肺腎等臟器的分布。
　　4.蒲黃-五靈脂主要效應(yīng)成分群在大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物分析與鑒定。對蒲黃-五靈脂藥對主要效應(yīng)成分群在大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物進行鑒定與分析研究，鑒定了蒲黃-五靈脂藥對在大鼠血漿、尿液、膽汁中有機酸及黃酮類成分的代謝物，從蒲黃-五靈脂合煎液給藥后大鼠血漿、尿液、膽汁中初步鑒定了29個代謝產(chǎn)物成分，分別為沒食子酸的3個代謝產(chǎn)物，原兒茶酸的5個代謝產(chǎn)物，香草酸的8個代謝產(chǎn)物，

9、香蒲新苷的3個代謝產(chǎn)物，異鼠李素3-O-新橙皮糖苷的3個代謝產(chǎn)物，對香豆酸的7個代謝產(chǎn)物。主要代謝途徑有羥化、甲基化、磺化、葡糖醛酸化、去甲基化、失氧等多種類型。
　　5.基于代謝組學(xué)的蒲黃-五靈脂作用機理探討。采用冰水浴并注射鹽酸腎上腺素法制備大鼠寒凝血瘀大鼠模型，運用UPLC-Q-TOF/MS聯(lián)用技術(shù)分析給予蒲黃-五靈脂藥對后大鼠血漿、尿液和膽汁中內(nèi)源性代謝物圖譜的變化，并使用模式識別技術(shù)分析正常組、模型組及給藥組間血漿、尿液

10、及膽汁的內(nèi)源性代謝物差異，找到與蒲黃-五靈脂藥對活血化瘀功效密切相關(guān)的潛在10個生物標(biāo)記物;分析蒲黃-五靈脂藥對對潛在生物標(biāo)志物。結(jié)果表明，蒲黃五靈脂具有活血化瘀功效并對寒凝血瘀證具有一定的修復(fù)作用。且寒凝血瘀證狀態(tài)下，大鼠尿液中與能量代謝相關(guān)的葡糖醛酸水平下降，說明寒凝血瘀證模型大鼠血糖反應(yīng)降低，三羧酸循環(huán)減弱，長時間的能量不足，需要一些能量代謝的旁路途徑進行代償，導(dǎo)致戊糖和葡萄糖醛酸互變代謝發(fā)生異常。
　　6.蒲黃-五靈脂配伍

11、對ADP誘導(dǎo)的血小板聚集和抗凝血作用研究。采用體外ADP誘導(dǎo)的血小板聚集、凝血酶時間(TT)和凝血酶原時間(PT)法，對蒲黃、五靈脂配伍前后單煎、分煎、合煎液有機酸、黃酮類化合物及單體化合物的變化進行研究，結(jié)果表明，蒲黃五靈脂合煎液、蒲黃五靈脂合并液均有顯著的抗血小板聚集和延長凝血酶時間活性。同樣生藥劑量下，蒲黃五靈脂合煎液凝血酶時間(TT)延長率大于分煎混合液。蒲黃五靈脂合煎液及分煎混合液與空白對照組比較均具有顯著抑制血小板聚集活性(