ZEB2基因3＇非翻譯區(qū)對(duì)胃癌EMT過程及GES-1細(xì)胞生長影響的體外研究.pdf

1、目的：
　　胃癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，位居我國惡性腫瘤死亡率的前列。目前，盡管胃癌的手術(shù)和其他治療方法都有很大的提高，預(yù)后卻不令人滿意。從分子水平來全面理解胃癌發(fā)生進(jìn)展的機(jī)理，并在此基礎(chǔ)上尋求有效的防治方法依然是當(dāng)前胃癌研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。
　　上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)在惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中的作用已受到很大的關(guān)注。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化指上皮細(xì)胞失去極性，轉(zhuǎn)化為成

2、纖維細(xì)胞形態(tài)，與周圍細(xì)胞的接觸減少，細(xì)胞黏附力下降，遷移和運(yùn)動(dòng)能力增加。此過程中，上皮細(xì)胞標(biāo)志物如E-鈣粘蛋白(E-cadherin)等表達(dá)下調(diào)，間葉表型標(biāo)記物如波形蛋白(vimentin)等表達(dá)上調(diào)。明確EMT在胃癌發(fā)生發(fā)展中可能的作用及機(jī)制，為胃癌的分子干預(yù)及臨床治療提供新的途徑和方法。
　　近年來，大量研究顯示非編碼RNA在多種生物學(xué)過程中具有重要的調(diào)控作用。微RNA（microRNA，miRNA）是非編碼RNA家族中被研究

3、得最多的成員，是長約22 nt的短鏈非編碼RNA，可與目標(biāo)RNA部分互補(bǔ)結(jié)合，與miRNA結(jié)合的序列稱為miRNA反應(yīng)元件(MREs)，結(jié)合后能夠通過促進(jìn)靶mRNA的降解和（或）抑制其翻譯而負(fù)性調(diào)控基因的表達(dá)。人們對(duì)miRNA-mRNA的作用已有足夠的認(rèn)識(shí)，但關(guān)于mRNA-miRNA反向作用卻知之甚少。一些非編碼轉(zhuǎn)錄包括基因非翻譯區(qū)(untranslated regions，UTRs)作為競爭性RNA通過競爭miRNA池調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)

4、展，但其作用機(jī)制及影響目前尚不明確。
　　方法：本課題分兩部分進(jìn)行:
　　第一部分:
　　以ZEB2為研究對(duì)象，脂質(zhì)體Lipofectamine2000分別將人工合成的ZEB23'UTR質(zhì)粒及其siRNA轉(zhuǎn)染入人胃腺癌細(xì)胞SGC7901，實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time PCR)檢測轉(zhuǎn)染后miR-200a/b/c的表達(dá)， Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲遷移能力，蛋白印跡（Western blo

5、t）方法檢測轉(zhuǎn)染后ZEB2及EMT相關(guān)指標(biāo)E-cadherin、Vimentin蛋白的表達(dá)水平。
　　第二部分:
　　將人工合成的ZEB23'UTR質(zhì)粒及miR-200b micmics采用脂質(zhì)體Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染GES-1細(xì)胞。RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后miR-200a/b/c及ZEB1/ZEB2 mRNA的表達(dá);Western blot檢測轉(zhuǎn)染后ZEB1/ZEB2、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2/9、增殖細(xì)

6、胞核抗原(PCNA)蛋白的表達(dá);Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲遷移能力;MTT法檢測細(xì)胞增殖活性。
　　結(jié)果：
　　第一部分:Real-time PCR顯示ZEB23'UTR轉(zhuǎn)染后，miR-200a/b/c的表達(dá)均明顯下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，以miR-200b最為明顯，而siRNA干擾ZEB2基因后miR-200a/b/c表達(dá)則均上調(diào)。轉(zhuǎn)染ZEB23'UTR質(zhì)粒組細(xì)胞的遷移、侵襲活性均較對(duì)

7、照組增強(qiáng)，而轉(zhuǎn)染ZEB2 siRNA后，SGC7901細(xì)胞的遷移、侵襲則有明顯減弱。蛋白印跡法顯示ZEB23'UTR轉(zhuǎn)染導(dǎo)致ZEB2表達(dá)上調(diào)，E-cadherin表達(dá)下調(diào)，而Vimentin則表達(dá)上調(diào)，而轉(zhuǎn)染ZEB2 siRNA后，各項(xiàng)指標(biāo)則表現(xiàn)出相反的表達(dá)趨勢。
　　第二部分:與對(duì)照組及突變組相比，轉(zhuǎn)染ZEB23'UTR組miR-200a/b/c的表達(dá)均下調(diào)，以miR-200b最為明顯，ZEB1/ZEB2 mRNA及蛋白水平表達(dá)

8、上調(diào)，細(xì)胞遷移、侵襲、增殖活性均增強(qiáng)(P＜0.05)。而聯(lián)合miR-200b micmics組較ZEB23'UTR組遷移、侵襲、增殖活性降低。
　　結(jié)論：
　　ZEB23'UTR可以通過調(diào)控miR-200a/b/c的表達(dá)調(diào)控胃癌細(xì)胞EMT過程，在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移中具有重要作用。ZEB23'UTR可能通過調(diào)控miR-200a/b/c的表達(dá)進(jìn)而影響其對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，增加細(xì)胞的侵襲、遷移能力，導(dǎo)致GES-1細(xì)胞的惡性