ZEB2對(duì)胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的影響及其機(jī)制的研究.pdf

1、第一章ZEB2、E-cadherin在胃癌組織和胃癌細(xì)胞株中的表達(dá)及意義
　　 目的:研究ZEB2、E-cadherin在胃癌組織和胃癌細(xì)胞株中的表達(dá)及其意義。
　　 方法:采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)胃癌組織及非癌性胃黏膜組織中ZEB2、E-cadherin蛋白的表達(dá)，分析ZEB2和E-cadherin的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系，用Kaplan-Meier和Cox回歸分析法進(jìn)行生存分析。采用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)人胃黏膜上皮細(xì)

2、胞株GES-1及胃癌細(xì)胞株SGC7901和HGC27中ZEB2mRNA和E-cadherinmRNA的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1.在胃癌組織中ZEB2陽性表達(dá)率(59.2％)明顯高于非癌性胃組織(19.0％)，其表達(dá)與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)(P＜0.05)，與年齡、性別、腫瘤大小和分化程度無關(guān)(P＞0.05)。Kaplan-Meier生存分析顯示，ZEB2陽性表達(dá)組、陰性表達(dá)組患者術(shù)后平均生存時(shí)間分

3、別為37.603±3.909mo，52.258±4.046mo;ZEB2陽性表達(dá)組患者的5年生存率明顯低于陰性表達(dá)組患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 2.在胃癌組織中E-cadherin陽性表達(dá)率(56.6％)明顯低于非癌性胃組織(100％)，其表達(dá)與腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)(P＜0.05);與年齡、性別和腫瘤大小無關(guān)(P＞0.05)。Kaplan-Meier生存分析顯示，E-cadher

4、in陽性表達(dá)組、陰性表達(dá)組患者術(shù)后平均生存時(shí)間分別為52.473±3.675mo，32.667±4.225mo;E-cadherin陽性表達(dá)組患者的5年生存率明顯高于陰性表達(dá)組患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3.ZEB2與E-cadherin在胃癌組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性(r=-0.295，P=0.01)。
　　 4.胃癌細(xì)胞株中ZEB2mRNA的相對(duì)表達(dá)量高于人胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1(P＜0.05)，

5、且胃癌細(xì)胞株HGC27中ZEB2mRNA相對(duì)表達(dá)量最高。
　　 5.胃癌細(xì)胞株中E-cadherinmRNA的相對(duì)表達(dá)量低于人胃黏膜膜上皮細(xì)胞株GES-1(P＜0.05)，且胃癌細(xì)胞株HGC27中E-cadherinmRNA相對(duì)表達(dá)量最低。
　　 結(jié)論:
　　 1.胃癌組織和胃癌細(xì)胞株中均存在ZEB2的高表達(dá)和E-cadherin的下調(diào)表達(dá)，其可能參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展過程。
　　 2.ZEB2、E-cad

6、herin在胃癌組織中的表達(dá)與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及預(yù)后相關(guān)，其異常表達(dá)可能參與胃黏膜的惡性轉(zhuǎn)變，在胃癌浸潤轉(zhuǎn)移中起一定的作用。
　　 3.在胃癌組織中ZEB2與E-cadherin的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性，ZEB2可能通過抑制E-cadherin的表達(dá)促進(jìn)胃癌的轉(zhuǎn)移。
　　 第二章靶向ZEB2基因的shRNA表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定
　　 目的:構(gòu)建靶向ZEB2基因的短發(fā)夾RNA(shRNA)真核表達(dá)質(zhì)粒，

7、并進(jìn)一步研究其對(duì)人胃癌HGC27細(xì)胞ZEB2表達(dá)的抑制效應(yīng)。
　　 方法:設(shè)計(jì)3條靶向ZEB2基因的shRNA，經(jīng)退火成互補(bǔ)雙鏈，克隆到質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo中構(gòu)建重組載體(pGPU6/GFP/Neo-ZEB2-shRNA1，2，3)，經(jīng)酶切鑒定和測(cè)序確認(rèn)后，將3個(gè)重組表達(dá)載體利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染到人胃癌細(xì)胞株HGC27，采用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)，利用Real-timePCR，Westernblot法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后Z

8、EB2mRNA和蛋白表達(dá)的情況，并篩選出最佳抑制效率的shRNA表達(dá)質(zhì)粒。
　　 結(jié)果:
　　 1.通過酶切鑒定和測(cè)序分析，靶向ZEB2基因的3個(gè)pGPU6/GFP/Neo-shRNA重組載體構(gòu)建成功。
　　 2.重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HGC27細(xì)胞后，經(jīng)Real-timePCR檢測(cè)，3個(gè)重組表達(dá)載體pGPU6/GFP/Neo-ZEB2-shRNA1，2，3對(duì)ZEB2mRNA表達(dá)的抑制率分別為81％，42％，74％;經(jīng)We

9、sternblot檢測(cè)，3個(gè)重組表達(dá)載體pGPU6/GFP/Neo-ZEB2-shRNA1，2，3對(duì)ZEB2蛋白表達(dá)的抑制率分別為73％，33％，64％;與空白對(duì)照組（HGC27細(xì)胞）相比較，質(zhì)粒ZEB2-shRNA1抑制ZEB2表達(dá)的效應(yīng)最佳，有顯著性差異(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.成功構(gòu)建靶向ZEB2基因的shRNA真核表達(dá)質(zhì)粒。
　　 2.構(gòu)建的3個(gè)重組表達(dá)載體均可有效抑制HGC27細(xì)胞中Z

10、EB2的表達(dá)，其中ZEB2-shRNA1抑制效果最強(qiáng)，為后續(xù)研究打下了基礎(chǔ)。
　　 第三章ZEB2基因沉默對(duì)HGC27細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其機(jī)制的研究
　　 目的:研究RNAi介導(dǎo)ZEB2基因沉默對(duì)人胃癌HGC27細(xì)胞增殖、侵襲及遷移等細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其機(jī)制。
　　 方法:實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為3組，即轉(zhuǎn)染陽性重組質(zhì)粒ZEB2-shRNA1的實(shí)驗(yàn)組，轉(zhuǎn)染陰性質(zhì)粒ZEB2-shRNANC的陰性對(duì)照組和未轉(zhuǎn)染的的空白對(duì)

11、照組。分別檢測(cè)ZEB2下調(diào)前后的人胃癌HGC27細(xì)胞生物學(xué)行為的變化，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況;Transwell小室測(cè)定細(xì)胞的遷移和侵襲能力;經(jīng)Westernblot法分析ZEB2基因沉默對(duì)EMT上皮標(biāo)志物E-cadherin，間質(zhì)標(biāo)志物fibronecin，vimentin及其MMPs家族中MMP2，MMP9蛋白表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1.MTT結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組，陰性對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組中HGC27

12、細(xì)胞的增殖能力無明顯改變(P＞0.05)。
　　 2.細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組HGC27細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)顯著少于空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組（14.3±2.5vs.39.5±3.6&38.2±3.2）(P＜0.05)。
　　 3.細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組HGC27細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)顯著少于空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組（21.4±2.5vs.47.3±4.5&45.7±3.5）(P＜0.05)。
　　 4.Westernblot結(jié)果顯示

13、，與空白對(duì)照組，陰性對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組E-cadherin蛋白的表達(dá)上調(diào)，而vimentin，fibronectin，MMP2和MMP9蛋白的表達(dá)下降。
　　 結(jié)論:
　　 1.ZEB2表達(dá)下調(diào)可降低HGC27細(xì)胞的遷移和侵襲能力，而對(duì)HGC27細(xì)胞的增殖無明顯影響，ZEB2可能在調(diào)控胃癌發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移過程中起關(guān)鍵性作用。
　　 2.ZEB2表達(dá)下調(diào)可誘導(dǎo)E-cadherin蛋白的重新表達(dá)，抑制vimentin，f