幽門螺旋桿菌感染對人胃上皮細(xì)胞(GES-1)RECK基因表達(dá)的影響及其調(diào)控的研究.pdf

1、目的：
　　RECK（reversion inducing cysteine-rich protein with kazal motifs）基因是新型基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑。本文研究幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori, Hp)感染人胃上皮細(xì)胞系GES-1后，對其RECK基因啟動子區(qū)域的甲基化以及mRNA表達(dá)水平的影響，及其NF-κB在Hp誘導(dǎo)RECK基因表達(dá)異常中的作用。探討Hp感染致胃癌的可能機(jī)制。
　　方

2、法：
　　用培養(yǎng)的Hp按感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）為0.5:1的濃度感染GES-1細(xì)胞，培養(yǎng)0～144h。感染結(jié)束后，提取細(xì)胞DNA，采用甲基化特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Methylation-specific PCR，MSP)法檢測RECK啟動子區(qū)域的甲基化及非甲基化情況；采用逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）檢測GES-1細(xì)胞內(nèi)RECK mRNA水平；提取細(xì)胞總蛋白和核蛋白，Western b

3、lot檢測p65的核轉(zhuǎn)位情況；為進(jìn)一步探討NF-κB與RECK基因表達(dá)的關(guān)系，Hp在感染GES-1細(xì)胞的同時，加入25μM NF-κB特異性抑制劑二硫代氨基甲酸吡咯烷（pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC）共同孵育，RT-PCR檢測其對RECK表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：
　　（1）Hp感染GES-1細(xì)胞0~72h內(nèi)，MSP結(jié)果顯示，尚未檢測出RECK基因甲基化條帶，但能檢測出明顯的非甲基化條帶。當(dāng)H

4、p感染96h后，MSP能檢測出微量的RECK甲基化條帶。感染144h后，GES-1細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)了明顯的甲基化RECK條帶，此時非甲基化條帶明顯減弱。
　?。?）Hp感染GES-1細(xì)胞144h后，RT-PCR結(jié)果顯示， RECK基因mRNA水平明顯降低，而在0~72h內(nèi)表達(dá)水平無明顯變化。
　?。?）Hp感染24h后即可檢測出p65蛋白轉(zhuǎn)移至核內(nèi)，表明Hp感染GES-1細(xì)胞后能激活其NF-κB，24~72h時間內(nèi)NF-κB激活水